白酒酒醅中纖維素酶產(chǎn)生菌的產(chǎn)酶活力與其生理生化特性的研究

郭建華，劉 冀，郭宏文，劉曉蘭，杜國軍，賈士儒

(1.齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，黑龍江齊齊哈爾161006;2.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津300222)

不同地域不同香型和風(fēng)味的白酒在發(fā)酵過程中具有不同的復(fù)雜的微生物菌群［1］，這為新菌種的發(fā)現(xiàn)和功能利用提供了巨大的發(fā)展空間。白酒發(fā)酵酒醅中含有多種纖維素酶產(chǎn)生菌，它們產(chǎn)生的纖維素酶對(duì)白酒的生產(chǎn)質(zhì)量起著重要的作用，不僅能影響白酒中的醛、醇、有機(jī)酸、酯等風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)量［2-3］，而且可以提高白酒的出酒率［4］。從發(fā)酵酒醅中篩選出能最大限度地降解木屑、農(nóng)作物秸稈、廢紙等工農(nóng)業(yè)及生活纖維廢棄品等產(chǎn)纖維素酶的微生物或酶制劑組成復(fù)合功能菌群用于發(fā)酵生產(chǎn)工業(yè)中，或者開發(fā)其在能源方面的應(yīng)用等，對(duì)環(huán)保及能源開發(fā)都具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。微生物發(fā)酵生產(chǎn)是一個(gè)復(fù)雜的生理生化代謝過程，不同的纖維素酶產(chǎn)生菌進(jìn)行纖維素酶發(fā)酵必然受到微生物的生理生化特性的影響，表現(xiàn)出不同的產(chǎn)酶活力。研究酒醅中纖維素酶產(chǎn)生菌的產(chǎn)酶及生理生化特點(diǎn)，對(duì)明確它們?cè)诎拙瓢l(fā)酵過程中的作用以及開發(fā)菌種的應(yīng)用具有重要的意義。微生物細(xì)胞的產(chǎn)酶能力與其生理生化性狀之間存在相關(guān)性，如沈業(yè)壽等［5］研究了竹蓀菌株產(chǎn)纖維素酶活與培養(yǎng)性狀之間的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)供試竹蓀菌產(chǎn)酶能力與菌體生長(zhǎng)速率等性狀之間存在正相關(guān)性;翁海波等［6］研究發(fā)現(xiàn)，利用土曲霉M11液態(tài)發(fā)酵時(shí)菌絲球的形態(tài)與發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶活力密切相關(guān)。迄今為止，關(guān)于微生物生理生化特性與產(chǎn)酶之間的相關(guān)性研究集中于微生物形態(tài)與產(chǎn)量之間的關(guān)系［7-10］。很多學(xué)者在進(jìn)行纖維素酶產(chǎn)生菌的篩選時(shí)，都測(cè)定了菌株的生理生化特性［11-13］，但一般是用來對(duì)菌株進(jìn)行初步的鑒定分類，而探討微生物生理生化特性與產(chǎn)酶相關(guān)性的研究還少有報(bào)道。本文利用從某白酒廠酒醅中分離出的20株產(chǎn)纖維素酶的細(xì)菌為研究材料，測(cè)定了它們的部分生理生化特性和發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的能力，并利用相關(guān)分析和通徑分析，研究了纖維素酶產(chǎn)生菌的生理生化特性與其產(chǎn)酶能力之間的相關(guān)性，并探討了各種生理生化特性指標(biāo)對(duì)細(xì)菌產(chǎn)纖維素酶活力的直接影響和間接影響。為更深入地研究微生物產(chǎn)纖維素酶的特點(diǎn)奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

20株產(chǎn)纖維素酶的細(xì)菌 從某白酒廠堆積酒醅和出窖酒醅中分離得到。從堆積酒醅中篩選出7株纖維素酶產(chǎn)生菌，標(biāo)號(hào)為D-1～D-7，出窖酒醅中篩選出13株纖維素酶產(chǎn)生菌，標(biāo)號(hào)為C-1～C-13。

振蕩培養(yǎng)箱 常州國華電器有限公司;生化培養(yǎng)箱SPX-150II 天津泰斯特儀器有限公司;TU-1810紫外可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司。

1.2 發(fā)酵纖維素酶活力的測(cè)定

1.2.1 種子液的制備 將纖維素酶產(chǎn)生菌從試管斜面接到滅菌之后的肉湯培養(yǎng)基中，置于恒溫培養(yǎng)箱中，在37℃下以120r/min培養(yǎng)12h，備用。

1.2.2 發(fā)酵液的制備 將種子液按照10%的接種比例接到滅菌之后的液體CMC培養(yǎng)基中，在37℃下以120r/min培養(yǎng)24h。

1.2.3 纖維素酶活力的測(cè)定 將培養(yǎng)好的發(fā)酵液，然后倒入離心管中，5000r/min離心10min，上清液即為發(fā)酵酶液。利用DNS法測(cè)定其纖維素酶活力，測(cè)定方法見參考資料［14］。

1.3 細(xì)菌生理生化特性的測(cè)定

1.3.1 革蘭氏染色 實(shí)驗(yàn)方法見參考資料［15］。為了分析方便，如果結(jié)果呈陽性，用數(shù)字“1”表示;結(jié)果呈陰性，用數(shù)字“0”表示。

1.3.2 細(xì)菌細(xì)胞長(zhǎng)寬比的測(cè)定 利用顯微測(cè)微尺測(cè)定細(xì)菌細(xì)胞的長(zhǎng)度和寬度［6］，兩者數(shù)值相比為細(xì)胞長(zhǎng)寬比。

1.3.3 糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn) 分別測(cè)定細(xì)菌對(duì)葡萄糖和乳糖的發(fā)酵特性，測(cè)定方法見文獻(xiàn)［15］。如果結(jié)果呈陽性，用數(shù)字“1”表示;結(jié)果呈陰性，用數(shù)字“0”表示。

1.3.4 淀粉水解實(shí)驗(yàn)和酪蛋白水解實(shí)驗(yàn) 淀粉水解實(shí)驗(yàn)方法見參考資料［16］。酪蛋白實(shí)驗(yàn)見參考資料［16］。如果實(shí)驗(yàn)結(jié)果呈陽性，利用游標(biāo)卡尺分別測(cè)量透明圈和菌落平均直徑，計(jì)算透明圈直徑與菌落直徑的比值;如果實(shí)驗(yàn)結(jié)果呈陰性，結(jié)果記為“0”。

1.3.5 過氧化氫酶實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)方法見參考資料［16］。如果結(jié)果呈陽性，用數(shù)字“1”表示;結(jié)果呈陰性，用數(shù)字“0”表示。

1.3.6 檸檬酸鹽實(shí)驗(yàn)和硫化氫產(chǎn)生實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)方法見參考資料［15］。如果結(jié)果呈陽性，用數(shù)字“1”表示;結(jié)果呈陰性，用數(shù)字“0”表示。

1.4 相關(guān)性分析和主成分分析

利用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPASS 13.0實(shí)現(xiàn)相關(guān)分析和通徑分析［17］。

2 結(jié)果與討論

2.1 纖維素酶產(chǎn)生菌的生理生化特性指標(biāo)與其產(chǎn)纖維素酶活力之間的相關(guān)系數(shù)

測(cè)定20株纖維素酶產(chǎn)生菌的部分生理生化特性和它們的發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的活力，結(jié)果如表1所示。

表1表明，20株纖維素酶產(chǎn)生菌革蘭氏染色均為陽性;硫化氫實(shí)驗(yàn)均為陰性;糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)表明，所有菌株都不能利用乳糖產(chǎn)氣;而其他生理生化特性隨著菌株的不同都有很大差別。微生物的生理生化指標(biāo)在一定程度上反映了細(xì)胞產(chǎn)不同酶的能力大小，如淀粉水解實(shí)驗(yàn)中透明圈與菌落直徑的比值代表了細(xì)菌產(chǎn)淀粉酶能力的大小。微生物細(xì)胞是一個(gè)有機(jī)整體，其各種生理生化特性與其產(chǎn)纖維素酶能力之間存在著不同程度的關(guān)聯(lián)。利用相關(guān)分析計(jì)算20株細(xì)菌的發(fā)酵酶活大小與細(xì)胞的長(zhǎng)寬比、淀粉水解實(shí)驗(yàn)指標(biāo)、酪蛋白實(shí)驗(yàn)指標(biāo)、糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)指標(biāo)、檸檬酸鹽實(shí)驗(yàn)指標(biāo)及過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)指標(biāo)之間的相關(guān)系數(shù)，結(jié)果如表2所示。

從表2可知，20株細(xì)菌的生理生化特性指標(biāo)與產(chǎn)酶纖維素酶活力的相關(guān)度(相關(guān)系數(shù)的絕對(duì)值)大小順序?yàn)?淀粉水解實(shí)驗(yàn)指標(biāo)＞細(xì)胞長(zhǎng)寬比＞葡萄糖產(chǎn)酸＞乳糖產(chǎn)酸＞檸檬酸鹽實(shí)驗(yàn)指標(biāo)＞葡萄糖產(chǎn)氣＞過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)指標(biāo)＞酪蛋白實(shí)驗(yàn)指標(biāo)。其中細(xì)胞長(zhǎng)寬比和葡萄糖產(chǎn)酸實(shí)驗(yàn)指標(biāo)與菌株纖維素酶發(fā)酵酶活呈明顯的負(fù)相關(guān)性，其相關(guān)系數(shù)分別為-0.746和-0.734。

2.2 菌株的生理生化特性指標(biāo)對(duì)產(chǎn)纖維素酶活力的通徑分析

菌株的生理生化特性指標(biāo)與產(chǎn)纖維素酶活力的相關(guān)系數(shù)的大小僅僅表示兩者之間關(guān)系的密切程度，但是不能解釋和分析這種關(guān)系的構(gòu)成和來源。同時(shí)生理生化特性之間存在互相影響，要揭示生理生化特性指標(biāo)與纖維素酶活力之間的真實(shí)關(guān)系，需要通過通徑分析計(jì)算各個(gè)指標(biāo)對(duì)纖維素酶活力的直接作用和間接作用。通徑分析結(jié)果如表3所示。

從表3可以看出，各生理生化特性指標(biāo)對(duì)菌株發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶活力的直接作用(通徑系數(shù)絕對(duì)值)大小順序?yàn)?細(xì)胞長(zhǎng)寬比＞酪蛋白實(shí)驗(yàn)＞葡萄糖產(chǎn)酸＞葡萄糖產(chǎn)氣＞淀粉水解實(shí)驗(yàn)＞檸檬酸鹽實(shí)驗(yàn)=過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)＞乳糖產(chǎn)酸。

2.2.1 細(xì)胞長(zhǎng)寬比與產(chǎn)纖維素酶活力的關(guān)系 根據(jù)表3，細(xì)胞長(zhǎng)寬比對(duì)細(xì)菌產(chǎn)纖維素酶活的直接作用最大，其作用為負(fù)向作用，即細(xì)胞長(zhǎng)寬比越大，產(chǎn)酶活力越小。細(xì)胞長(zhǎng)寬比還通過淀粉水解指標(biāo)、葡萄糖產(chǎn)酸和葡萄糖產(chǎn)氣指標(biāo)的間接作用加強(qiáng)了對(duì)纖維素酶活力的負(fù)向作用;通過酪蛋白實(shí)驗(yàn)、乳糖產(chǎn)酸和檸檬酸鹽實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的正向間接作用，消弱了細(xì)胞長(zhǎng)寬比對(duì)纖維素酶活力的負(fù)向作用。其綜合效果使細(xì)胞長(zhǎng)寬比與纖維素酶活力的具有明顯的負(fù)相關(guān)性(相關(guān)系數(shù)為-0.7 4 6)，因此，在從酒醅中篩選具有纖維素酶產(chǎn)生能力的細(xì)菌時(shí)，細(xì)胞長(zhǎng)寬比是一個(gè)重要的考慮指標(biāo)。

表1 纖維素酶產(chǎn)生菌的生理生化特性指標(biāo)及發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶活力Table 1 Indicators of physiological and biochemical characteristics and ferment cellulase activity of cellulase producing bacteria

表2 生理生化特性與纖維素酶活力的相關(guān)系數(shù)Table 2 Correlation coefficients of physiological and biochemical characteristics and ferment cellulase activity

表3 生理生化特性和纖維素酶活力的通徑分析Table 3 Path analysis of physiological and biochemical characteristics and cellulase activity

2.2.2 淀粉水解實(shí)驗(yàn)指標(biāo)與產(chǎn)纖維素酶活力的關(guān)系 淀粉水解實(shí)驗(yàn)指標(biāo)對(duì)纖維素酶活力的直接作用很小，其直接通徑系數(shù)只有0.061，但是通過細(xì)胞長(zhǎng)寬比、葡萄糖產(chǎn)酸、葡萄糖產(chǎn)氣和酪蛋白實(shí)驗(yàn)指標(biāo)對(duì)纖維素酶活力的正向間接作用很大，從而增加了淀粉水解實(shí)驗(yàn)指標(biāo)與纖維素酶活力的相關(guān)度。在已測(cè)指標(biāo)中，淀粉水解實(shí)驗(yàn)指標(biāo)與纖維素酶活力的相關(guān)系數(shù)最大。這也說明纖維素酶產(chǎn)生菌產(chǎn)淀粉酶的能力和產(chǎn)纖維素酶的能力具有一致性。

2.2.3 葡萄糖產(chǎn)酸和葡萄糖產(chǎn)氣指標(biāo)與纖維素酶活力的關(guān)系 葡萄糖產(chǎn)酸指標(biāo)對(duì)纖維素酶活力的直接作用表現(xiàn)為負(fù)向，其直接通徑系數(shù)為-0.290，并且通過細(xì)胞長(zhǎng)寬比、淀粉水解實(shí)驗(yàn)和酪蛋白實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的負(fù)向間接作用增加了其與纖維素酶活力的負(fù)相關(guān)性(相關(guān)系數(shù)為-0.734)，說明菌株利用葡萄糖產(chǎn)酸抑制了纖維素酶的產(chǎn)生。葡萄糖產(chǎn)氣指標(biāo)對(duì)纖維素酶的活力的主要表現(xiàn)為直接正向作用，而間接作用很小。說明利用葡萄糖產(chǎn)氣對(duì)菌株產(chǎn)纖維酶的能力影響不大。

2.2.4 乳糖產(chǎn)酸指標(biāo)和檸檬酸鹽實(shí)驗(yàn)指標(biāo)與纖維素酶活力的關(guān)系 乳糖產(chǎn)酸指標(biāo)檸檬酸鹽實(shí)驗(yàn)指標(biāo)對(duì)纖維素酶活力都有很小的負(fù)向直接作用，但是通過細(xì)胞長(zhǎng)寬比、葡萄糖產(chǎn)酸和葡萄糖產(chǎn)氣的正向間接作用，使它們與纖維素酶活力之間具有一定的正相關(guān)性。因此，乳糖產(chǎn)酸和檸檬酸實(shí)驗(yàn)指標(biāo)主要是通過間接作用對(duì)纖維素酶活力產(chǎn)生影響。

2.2.5 酪蛋白實(shí)驗(yàn)指標(biāo)和過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)指標(biāo)與纖維素酶活力的關(guān)系 酪蛋白實(shí)驗(yàn)指標(biāo)對(duì)纖維素酶活力的直接作用排第2位，但是通過細(xì)胞長(zhǎng)寬比對(duì)纖維素酶活力產(chǎn)生了很大的負(fù)向間接作用，使得酪蛋白實(shí)驗(yàn)指標(biāo)與纖維素酶活力的相關(guān)性下降。而過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)指標(biāo)對(duì)纖維素酶活力有較小的正向直接作用，而且通過細(xì)胞長(zhǎng)寬比和葡萄糖產(chǎn)酸的正向間接作用，增加了與纖維素酶活力的相關(guān)性。這說明細(xì)菌分泌蛋白酶和過氧化氫酶與產(chǎn)纖維素酶之間的關(guān)系比較復(fù)雜，有待深入研究。

3 結(jié)論

根據(jù)相關(guān)性分析結(jié)果可知:酒醅中纖維素酶產(chǎn)生細(xì)菌的的生理生化特性指標(biāo)與其發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶之間具有不同程度的相關(guān)性。其中細(xì)胞長(zhǎng)寬比和葡萄糖產(chǎn)酸指標(biāo)與纖維素酶活力具有明顯的負(fù)相關(guān)性，而淀粉水解實(shí)驗(yàn)指標(biāo)與纖維素酶活力具有明顯的正相關(guān)性。根據(jù)通徑分析結(jié)果可知:細(xì)胞長(zhǎng)寬比對(duì)細(xì)菌產(chǎn)纖維素酶的負(fù)向直接作用最大;葡萄糖產(chǎn)酸指標(biāo)對(duì)纖維素酶活力有較強(qiáng)的負(fù)向直接作用;葡萄糖產(chǎn)氣和酪蛋白實(shí)驗(yàn)指標(biāo)對(duì)纖維素酶具有較強(qiáng)的正向直接作用;同時(shí)各個(gè)指標(biāo)還通過其他指標(biāo)對(duì)纖維素酶活力產(chǎn)生間接影響。細(xì)菌在發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶時(shí)，與其本身的生理生化特性間存在不同程度的相關(guān)性，明確生理生化指標(biāo)對(duì)纖維素酶產(chǎn)生的影響，有助于更好地開發(fā)和利用纖維素酶產(chǎn)生菌。

［1］唐玉明，姚萬春，任道群，等.醬香型白酒窖內(nèi)發(fā)酵過程中糟醅的微生物分析［J］.釀酒科技，2007(12):50-53.

［2］李旭暉，吳生文，張志剛.纖維素酶對(duì)大曲酒風(fēng)味物質(zhì)影響的探討［J］.中國釀造，2011(6):80-83.

［3］李旭暉，吳生文，張志剛，等.木聚糖酶在特型酒生產(chǎn)中的應(yīng)用［J］.釀酒科技，2011(5):65-68.

［4］邢曉晰，溫亞麗，王曉江.纖維素酶在白酒生產(chǎn)中的應(yīng)用研究［J］.釀酒科技，1998(5):32-33.

［5］沈業(yè)壽，王光存，胡江林，等.竹蓀菌株的纖維素酶活與培養(yǎng)性狀的相關(guān)性研究［J］.安徽大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，1993(3):83-91.

［6］翁海波，王會(huì)敏，許衛(wèi)華，等.土曲霉M11液體發(fā)酵時(shí)菌絲球形態(tài)與發(fā)酵產(chǎn)酶的關(guān)系［J］.鄭州大學(xué)學(xué)報(bào):理學(xué)版，2010，42(4):100-105.

［7］Papagianni M.Fungal morphology and metabolite production in submergedmycelial processes［J］.Biotechnol Adv，2004，22(3):189-259.

［8］Burla G，Garzillo A M，Luna M，et al.Effects of different growth conditions on enzyme production by Pleurotus ostreatus in submerged culture［J］.Bioresour Technol，1992，42(2):89-94.

［9］Johansen C L，Coolen L，Hunik J H.Influence of morphology on product formation in Aspergillus awamori during submerged fermentations［J］.Biotechnol Prog，1998，14(2):233-240.

［10］Yang F C，Huang H C，Yang M J.The influence of environmental conditions on the mycelial growth of A ntrodia cinnamomea in submerged cultures［J］.Enzyme MicrobTechnol，2003，33(4):395-402.

［11］葛春輝，徐萬里，邵華偉，等.一株產(chǎn)纖維素酶細(xì)菌的篩選、鑒定及其纖維素酶的部分特性［J］.生物技術(shù)，2009，19(1):36-40.

［12］張花美，龔志偉，潘熙萍，等.纖維素分解菌的分離鑒定及生物學(xué)特性研究［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，(5):448-451.

［13］趙菁，黃奮飛，林生，等.纖維素降解細(xì)菌的分離、鑒定及其系統(tǒng)發(fā)育分析［J］.安徽農(nóng)學(xué)通報(bào)，2010，17(17):47-48.

［14］錢嘉淵.酶的測(cè)定方法［M］.北京:中國輕工業(yè)出版社，1992:134-139.

［15］沈萍，范秀容，李廣武.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)［M］.第三版.北京:高等教育出版社，1996:28，46-48，119-120，120-123.

［16］杜連祥，路福平.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)［M］.北京:中國輕工業(yè)出版社，2005:164，159，161.

［17］李春喜，姜麗娜，邵云，等 .生物統(tǒng)計(jì)學(xué)［M］.第三版 .北京:科學(xué)出版社，2007:263-269.