紅三葉預加工廢水中葉綠素的提取及其穩定性研究

曾家豫，武偉國，孔維寶，劉雄雄，葸玉琴，楊 紅，趙 靜

(西北師范大學生命科學學院，甘肅蘭州730070)

葉綠素是一種含金屬卟啉、廣泛存在于自然界的天然色素，具有安全無毒、著色自然鮮艷等優點，廣泛應用于食品、化妝品及藥物的著色［1］;同時它還具有降低膽固醇、抗衰老、排毒、消炎、脫臭、清熱、止血、抗癌和抗突變等功能，在藥品、除臭劑及各種口服保健品中均得到廣泛應用［2-3］。紅三葉(Trifolium pratense L.)是豆科植物中一種重要的飼料用草，廣泛分布于全球各地，其中含有大量的異黃酮，質量約占其干重的0.5%～3.5%［4］，比其它豆科植物中異黃酮的含量高10～30倍［5］。紅三葉異黃酮具有弱雌激素作用，能有效改善婦女更年期綜合癥［6］、預防和治療動脈粥樣硬化［7］等疾病，因而被廣泛應用于臨床。此外，它還是一種極有前途的天然保健食品。紅三葉鮮青草預加工廢水是指為提取紅三葉中的異黃酮，對新鮮紅三葉進行擠壓和沖洗等操作時產生的廢水［8］。目前，此廢水大部分被直接排放河流中，由于其含有大量的糖、蛋白質和葉綠素等有機物，自然發酵后會釋放出硫化氫和氨氣等惡臭氣體，造成極大的資源浪費和環境污染。況且，我國水資源比較貧乏，尤其是西北部不少地區人畜飲水都很困難。因此，有必要利用現代生物技術手段凈化處理紅三葉預加工廢水，并盡可能回收利用其中的有機質。這樣既可達到消除污染、保護環境的目的，又可實現紅三葉預加工廢水的資源化利用。本研究以紅三葉鮮青草預加工廢水為原料，首先采用較低濃度的乙醇沉降其中的有機物，得到葉綠素粗提物;其次，采用醇提法浸提沉淀物中的葉綠素，并設計單因素及正交實驗優化提取工藝;最后對紅三葉葉綠素的穩定性進行研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅三葉鮮青草預加工廢水 由甘肅岷縣方正草業開發有限公司提供;無水乙醇等其它試劑 均為分析純。

U-1800紫外可見分光光度計 日本日立;TGL-5000B低溫冷凍離心機 上海安亭科學儀器廠;HHS-2數顯恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司;686型pH計 美國奧利龍;AW320分析天平 日本島津;XD電熱恒溫干燥箱 天津實驗儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 紅三葉葉綠素的粗提

1.2.1.2 固形物沉降率的測定 紅三葉預加工廢水中有機物的沉降效率可用固形物沉降率來表示。分別量取100mL廢水和醇沉后上清液，4000r/min離心15min，棄去上清液，沉淀物于105℃下烘干后稱重，固形物沉降率按式(1)計算:

其中，S表示固形物沉降率(%)，c1和c2分別表示廢水和醇沉后上清液中的固形物含量(g/L)。

1.2.2 葉綠素粗提物的純化

1.2.2.1 乙醇濃度對葉綠素提取率的影響 在7個50mL燒瓶中，均加入0.5g葉綠素粗提物，再分別以70% 、75% 、80% 、85% 、90% 、95% 、100% 的乙醇為浸提溶劑，料液比為1∶20(g/mL)，在50℃下浸提2h。分別以對應濃度的乙醇作為對照，測定浸提液的吸光度，計算葉綠素提取率。

1.2.2.2 浸提溫度對葉綠素提取率的影響 在6個50mL燒瓶中，均加入0.5g葉綠素粗提物，以90%乙醇為浸提溶劑，料液比為1∶20(g/mL)，分別在50、60、70、80、90、100℃ 下浸提 2h。測定浸提液的吸光度，計算葉綠素提取率。

1.2.2.3 浸提時間對葉綠素提取率的影響 在8個50mL燒瓶中，均加入0.5g葉綠素粗提物，以90%乙醇為浸提溶劑，料液比為1∶20(g/mL)，在50℃下分別浸提1、2、3、4、5、6、7、8h。測定浸提液的吸光度，計算葉綠素提取率。

1.2.2.4 料液比對葉綠素提取率的影響 在5個50mL燒瓶中，均加入0.5g葉綠素粗提物，以90%乙醇為浸提溶劑，料液比分別為 1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30(g/mL)，在50℃下浸提6h。測定浸提液的吸光度，計算葉綠素提取率。

設備成本也是瀝青路面施工成本控制工作的主要內容。施工設備成本控制中的問題主要體現在以下方面：（1）設備應用未能與實際施工情況和施工方案有效結合，設備操作人員沒有在充分了解設備性能和規格標準的情況下施工，導致設備在施工過程中出現故障，延誤了工期，對成本控制產生不利影響；（2）忽略了對設備的維修養護。一些企業在施工完成后，忽視了對機械的維護與養護，導致設備疲勞工作，并且存在質量隱患，各項性能受到影響，從而影響了工程施工進度，而且設備維修成本也會隨之而增加[1]。

1.2.2.5 葉綠素粗提物純化的正交實驗 為了進一步優化葉綠素粗提物純化的技術參數，設計3水平4因素正交實驗對提取條件進行優化。根據單因素實驗的結果確定各因素的合理水平，L9(34)正交實驗設計見表1。

1.2.2.6 葉綠素提取率的測定 以相應濃度的乙醇溶劑為對照，測定浸提液在649和665nm處的吸光度，葉綠素提取率按式(4)計算［9］:

其中，ca和cb分別表示葉綠素a和葉綠素b的濃度(mg/L);A649和 A665分別表示浸提液在649和665nm處的吸光度;w表示葉綠素提取率(mg/g);f表示浸提液的稀釋倍數;V表示浸提液的體積(mL);m表示葉綠素粗提物的質量(g)。

表1 正交實驗因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.2.3 葉綠素穩定性的研究 稱取5.0g葉綠素粗提物，溶于90%乙醇，料液比為1∶25(g/mL)，60℃下浸提6h，4000r/min離心15min，棄去沉淀物，上清液作為儲備液用于葉綠素穩定性研究。

1.2.3.1 光照對葉綠素穩定性的影響 移取10mL儲備液至50mL容量瓶中，用90%乙醇定容后，分別置于太陽光、室內自然光下以及棕色瓶中。定時測定稀釋液在649和665nm處的吸光度，并計算葉綠素含量。

1.2.3.2 溫度對葉綠素穩定性的影響 移取10mL儲備液至50mL容量瓶中，用90%乙醇定容后，分別置于 50、60、70、80、90、100℃水浴鍋中并避光。定時測定稀釋液在649和665nm處的吸光度，并計算葉綠素含量。

1.2.3.3 pH對葉綠素穩定性的影響 移取10mL儲備液至50mL容量瓶中，用0.1mol/L HCl或0.1mol/L NaOH 溶液調節其 pH 分別至 2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0，再用90%乙醇定容后，避光放置。定時測定稀釋液在649和665nm處的吸光度，并計算葉綠素含量。

1.2.3.4 氧化劑對葉綠素穩定性的影響 移取10mL儲備液至50mL容量瓶中，對照組用90%乙醇溶液定容，實驗組用含H2O2的90%乙醇溶液定容，定容后使H2O2的終濃度分別為0.2%、0.4%、0.6%、0.8%和1.0%，避光放置。定時測定稀釋液在649和665nm處的吸光度，并計算葉綠素含量。

1.2.3.5 金屬離子對葉綠素穩定性的影響 移取10mL儲備液至50mL容量瓶中，對照組用90%乙醇定容，實驗組分別用含 Fe2+、Fe3+、Cu2+、Zn2+和 Al3+的90%乙醇溶液定容，定容后使金屬離子的終濃度為0.25%，避光放置。定時測定稀釋液在649和665nm處的吸光度，并計算葉綠素含量。

1.2.3.6 葉綠素含量的測定 以90%乙醇為對照，分別測定葉綠素溶液在649和665nm處的吸光度，葉綠素含量按式(5)計算［9］:

其中，c表示葉綠素含量，f表示儲備液的稀釋倍數，ca和 cb分別表示葉綠素 a和葉綠素 b的濃度(mg/L)，它們的計算同1.2.2.6。

1.2.4 數據處理 每個實驗做3個平行，數據用SPSS13.0軟件進行統計學處理，采用最小顯著差異法(LSD)對不同組數據進行單因素方差分析，結果以“均值±標準差”的形式表示。

2 結果與討論

2.1 葉綠素粗提物的制備

如圖1所示，當用乙醇沉降紅三葉預加工廢水時，固形物沉降率隨著乙醇濃度的增大而提高。當廢水中不添加乙醇時，沉降率最低，與其它各實驗組相比差異極顯著(p＜0.01)，而且觀察不到沉降現象;當乙醇濃度為10%時，沉降率為31.85%，與乙醇濃度較高時相比，沒有極顯著差異(p＞0.01)，且上清液僅占約1/5;當乙醇濃度為20%和30%時，沉降率分別為37.21%和39.45%，差異不顯著(p＞0.05)，而上清液分別占約1/3和4/5;當乙醇濃度為40%時，沉降率為41.52%，與20%和30%時相比差異不顯著(p＞0.05);當乙醇濃度為50%時，雖然沉降率最大(43.22%)，但是已有少量葉綠素溶于上清液中。綜合考慮固形物沉降率、葉綠素濃縮效果和乙醇用量等因素，選擇30%乙醇沉降紅三葉預加工廢水中的葉綠素。

圖1 乙醇濃度對固形物沉降率的影響Fig.1 Effects of ethanol concentration on solid sedimentation rate

2.2 葉綠素粗提物的純化

2.2.1 乙醇濃度對葉綠素提取率的影響 如圖2所示，提取率隨著乙醇濃度的增大而提高，當乙醇濃度為90%時，提取率達到最大(1.55mg/g)，與85%和95%時相比差異顯著(p＜0.05)，與其它各實驗組相比差異極顯著(p＜0.01);當乙醇濃度為80%和100%時，提取率相對較低，二者差異不顯著(p＞0.05);當乙醇濃度為70%時，提取率最小(1.27mg/g)，與其它各實驗組相比差異極顯著(p＜0.01)。因此，葉綠素提取的最佳乙醇濃度為90%。

2.2.2 浸提溫度對葉綠素提取率的影響 如圖3所示，當浸提溫度為50、60、70℃時較適宜于提取，且60℃時提取率最大(1.55mg/g);之后，隨著溫度的升高，提取率逐漸減小，當溫度為90、100℃時提取率相對較小，與60℃時相比差異極顯著(p＜0.01)，而當溫度為100℃時，提取率最小(1.38mg/g)，與其它各實驗組相比差異顯著(p＜0.05)，究其原因可能是高溫導致了葉綠素的分解。因此，60℃為最佳浸提溫度。

圖2 乙醇濃度對葉綠素提取率的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on chlorophyll extraction rate

圖3 浸提溫度對葉綠素提取率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on chlorophyll extraction rate

2.2.3 浸提時間對葉綠素提取率的影響 如圖4所示，隨著浸提時間的延長，提取率逐漸增大，但變化不是很明顯。當浸提時間為1h時，提取率相對較低(1.50mg/g)，與2、3h時相比，沒有極顯著差異(p＞0.01)，但與其它各實驗組相比有極顯著差異(p＜0.01);當浸提時間為2、3、4、5h時，提取率之間沒有極顯著差異(p＞0.01);而當浸提時間為6h時，提取率達到最大(1.62mg/g)，如果再延長提取時間，提取率與6h時相比無顯著差異(p＞0.05)，這是因為當浸提時間達到6h時，原料中的可溶出物已近消失，所以超過6h后提取率增幅極小。因此，確定6h為適宜的浸提時間。

2.2.4 料液比對葉綠素提取率的影響 如圖5所示，隨著料液比的減小，提取率呈先增大后基本保持不變的趨勢。當料液比為1∶20(g/mL)時，提取率最大(1.63mg/g)，與1∶10(g/mL)時相比差異極顯著(p＜0.01)，與1∶15(g/mL)時相比差異顯著(p ＜0.05);當料液比為 1∶25、1∶30(g/mL)時，提取率與 1∶20(g/mL)時相比無顯著差異(p＞0.05)。因此，最佳料液比為1∶20(g/mL)。

圖4 浸提時間對葉綠素提取率的影響Fig.4 Effect of extraction time on chlorophyll extraction rate

圖5 料液比對葉綠素提取率的影響Fig.5 Effect of solid-to-liquid ratio on chlorophyll extraction rate

2.2.5 葉綠素粗提物純化的正交實驗 正交實驗結果見表2，方差分析結果見表3。由表2可知，4個因素對提取率影響作用的大小順序為A＞D＞B＞C，即乙醇濃度＞料液比＞浸提溫度＞浸提時間;由表3可知，乙醇濃度對提取率的影響極顯著(p＜0.01)，料液比對提取率的影響顯著(p＜0.05)，浸提溫度與時間對提取率有影響，但不顯著(p＞0.05)。本實驗中，最大提取率對應的因素組合為A2B2C3D2，即乙醇濃度90%、浸提溫度60℃、浸提時間6h和料液比1∶25(g/mL)。驗證實驗結果表明，在此優化工藝條件下提取率可達1.72mg/g。

表2 提取條件正交實驗結果Table 2 Results of orthogonal test for extraction condition

表3 正交實驗方差分析Table 3 Variance analysis for orthogonal test

2.3 葉綠素穩定性的研究

2.3.1 光照對葉綠素穩定性的影響 如圖6所示，光照對該葉綠素的穩定性有很大影響。在光照條件下，含量逐漸減少，且光照強度越大，變化越明顯，這表明光照加速了葉綠素的分解;在避光條件下，含量幾乎保持不變。因此，在運輸和儲存過程中，該葉綠素或用其著色的物質應盡量避免暴露于光下或長時間照射。

圖6 光照對葉綠素穩定性的影響Fig.6 Effect of light on stability of chlorophyll

2.3.2 溫度對葉綠素穩定性的影響 如圖7所示，當溫度小于60℃時，含量幾乎保持不變，溶液色澤鮮艷;當溫度在70～90℃之間時，含量減小較慢，可見，該葉綠素耐熱性良好;而當溫度大于100℃時，含量減小較快，原因可能是高溫加速了葉綠素的脫鎂反應。

圖7 溫度對葉綠素穩定性的影響Fig.7 Effect of temperature on stability of chlorophyll

2.3.3 pH對葉綠素穩定性的影響 如圖8所示，當pH≤4.0時，含量迅速降低，這可能是因為強酸會導致葉綠素脫鎂;當pH在6.0～8.0之間時，含量基本保持不變，且能保持相對穩定的色澤;但當pH≥10.0時，雖然含量基本保持不變，但是溶液逐漸變成黃色，這可能是因為強堿引起了葉綠素脫酯。因此，該葉綠素在弱酸或弱堿環境中比較穩定。

圖8 pH對葉綠素穩定性的影響Fig.8 Effect of pH on stability of chlorophyll

2.3.4 氧化劑對葉綠素穩定性的影響 如圖9所示，氧化劑對該葉綠素的穩定性有影響，但并不明顯。隨著過氧化氫濃度的增加，含量雖有降低，但幅度不大，說明該葉綠素抗氧化能力較強。

圖9 氧化劑對葉綠素穩定性的影響Fig.9 Effect of oxidant on stability of chlorophyll

2.3.5 金屬離子對葉綠素穩定性的影響 如圖10所示，各種金屬離子對該葉綠素穩定性的影響各不相同，Fe2+有助于其穩定性提高，并產生良好的護色效果;Zn2+和 Al3+對其穩定性的影響較小，但 Cu2+和Fe3+會加速葉綠素的分解，不利于其長時間保存。

3 結論

本文通過單因素及正交實驗對紅三葉預加工廢水中葉綠素的提取條件進行了研究。結果顯示，從廢水中沉降葉綠素制備葉綠素粗提物的最佳乙醇濃度為30%。粗提物中葉綠素的最佳浸提條件為乙醇濃度90%、浸提溫度60℃、浸提時間6h和料液比1∶25(g/mL)。在此條件下，葉綠素提取率可達1.72mg/g。由正交實驗的結果可見，這4個因素對葉綠素提取率的影響作用依次為乙醇濃度＞料液比＞浸提溫度＞浸提時間。本實驗得到的葉綠素具有良好的耐熱性、抗氧化性，在弱酸、弱堿環境中較穩定，Fe2+有助于其穩定性的提高，但在光照條件下易發生降解現象。本實驗采用醇沉法沉降紅三葉預加工廢水中的有機物，并采用醇提法浸提沉淀物中的葉綠素，操作簡便，效價比高，所用試劑安全無毒，葉綠素損失率小，為該類廢水及類似廢水的凈化處理和有效利用提供了科學依據，所得紅三葉葉綠素在食品、藥品等工業中具有潛在的應用價值。

圖10 金屬離子對葉綠素穩定性的影響Fig.10 Effect of metal ions on stability of chlorophyll

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