FRAP法微量模型的建立

盧 引，尹震花，康文藝

(河南大學(xué)中藥研究所，河南開封475004)

槲皮素(quercetin)是活性明確的黃酮類抗氧化活性成分之一，具有抗氧化劑清除自由基作用、防止DNA氧化損傷、防止炎癥介質(zhì)的釋放等作用［1-3］。2，6-二叔丁基對甲酚(butylated hydroxytolu-ene，簡稱BHT)，由于對熱穩(wěn)定，與金屬離子反應(yīng)不著色，能通過自身氧化而保護其他易氧化組分［4］，它可以保持食品的新鮮、營養(yǎng)成分、口味、顏色，并能提高藥品、化妝品、脂溶性維生素的穩(wěn)定性，作為抗氧化劑廣泛用于食品和藥品中［5］。且與其他抗氧化劑相比，BHT具有穩(wěn)定性較高，耐熱性較好等特點［6］。而PG、BHA也是使用較廣泛的穩(wěn)定的抗氧化劑?？偪寡趸芰υu估法FRAP法(Ferric reducing antioxidant power)其原理為在低pH3.6的非生理條件下，抗氧化成分將［Fe(Ⅲ)-(TPTZ)2］復(fù)合物還原為有色的〔Fe(Ⅱ)-(TPTZ)2〕復(fù)合物。該方法操作簡單、實驗儀器要求低、易于標準化，且由于其反映的不是針對某一種自由基的清除活性，而是樣品總的還原能力，因此FRAP法被認為能較好地反映樣品總抗氧化活性［7］。目前還有以下衡量總體抗氧化活性的方法，常用的有TOSC 法、FRAP法和 TRAP法［8］。國內(nèi)外利用FRAP法檢測天然產(chǎn)物的抗氧化活性主要用的是分光光度法，該方法在篩選樣品時，樣品消耗量大，操作繁瑣費時。本研究通過單因素考察，建立正交實驗表，用槲皮素建立FRAP抗氧化微量篩選微量模型，以建立一個簡單、節(jié)約、有效的抗氧化測定模型。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

TPTZ(2，4，6-Tri(2-pyridyl)-s-triazine)Acros organics;BHT(二丁基羥基甲苯)比利時Acros organics 公司;Trolox(6-hydroloxy-2，5，7，8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid)Aldrich;槲皮素 河南大學(xué)中藥研究所提供，純度為98%;其它試劑 均為分析純。

電子天平 美國Mettler-Toledo公司;Multiskan MK3酶標儀 Thermo Electron;UV-2000型紫外可見分光光度計 上海尤尼科儀器有限公司;KQ3200型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;CS-H1型混合器 北京博勵陽科技公司;各種規(guī)格移液器等。

1.2 實驗方法

1.2.1 單因素實驗 用96微孔板法對影響FRAP法的三個主要因素:TPTZ溶液的濃度、TPTZ溶液的加入量及反應(yīng)時間進行單因素考察實驗，確定FRAP法的最佳因素水平，并根據(jù)本實驗室的條件及有關(guān)報道，對實驗波長進行了考察。

1.2.2 正交實驗 按照單因素實驗結(jié)果，選擇TPTZ溶液的濃度、TPTZ溶液的加入量和反應(yīng)時間為主要因素，進行正交實驗設(shè)計，各因素水平設(shè)置見表1，按L9(34)正交表進行實驗(n=3)。

表1 因素水平表Table 1 Factors level table

1.2.3 驗證實驗 根據(jù)正交實驗確定的最佳實驗條件，重復(fù)實驗(n=3)，驗證該模型的穩(wěn)定性，并以BHT做陽性對照，分別用微量法和分光光度法［9］對BHT和槲皮素進行抗氧化活性測定，結(jié)果以TEAC當量表示，驗證該模型的準確性。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素考察結(jié)果

單因素實驗結(jié)果見圖1～圖3。

圖1 TPTZ濃度對吸光度的影響Fig.1 The influence of the concentration of TPTZ to absorbance

圖2 反應(yīng)時間對吸光度的影響Fig.2 The influence of the time to absorbance

圖3 加入量對吸光度的影響Fig.3 The influence of the addition to absorbance

由單因素實驗得出當TPTZ為1倍量濃度(0.3mol/L醋酸鈉緩沖液，10mmol/L TPTZ溶液，20mmol/L氯化鐵溶液三者按照順序體積比為10∶1∶1)，TPTZ 加入量為 225μL，反應(yīng)時間為 50min時槲皮素的抗氧化能力最強。由波長考察結(jié)果得出本實驗最佳測定波長為595nm。

2.2 正交實驗結(jié)果

正交實驗結(jié)果見表2、表3。

表2 正交實驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 The orthogonal experiment design and results

表3 方差分析表Table 3 Anova table

由表2的R值可知，三因素對實驗結(jié)果的影響順序是A＞B＞C，由此可說明TPTZ溶液濃度是最重要的影響因素，TPTZ加入量和反應(yīng)時間次之。因素A對實驗結(jié)果的影響最大，從表2可知最佳水平為A2，因素B和C的影響相對來說較小，根據(jù)表2也可以得出最佳水平為B1和C3，但是鑒于因素C對結(jié)果影響甚微，為了節(jié)約時間我們選擇C1為最佳反應(yīng)時間。故最佳實驗條件為:A2B1C1，即一倍量的TPTZ溶液，加入量為200μL，反應(yīng)時間為40min。

2.3 驗證實驗結(jié)果

為了獲取模型的穩(wěn)定性和準確性，我們對以上最佳實驗結(jié)果進行了重復(fù)性實驗(n=3)和標準品對照實驗。結(jié)果見表4、表5。

表4 驗證實驗結(jié)果Table 4 Experimental results verify

表5 標準品對照實驗結(jié)果Table 5 The standard control experiment results

由表4可知重復(fù)性實驗結(jié)果RSD值為0.082%，說明結(jié)果穩(wěn)定可靠。

由表5可知，分光光度法和微量法測得的四種樣品抗氧化活性順序一致，即:PG＞BHA＞槲皮素＞BHT，且兩種方法的相關(guān)系數(shù)r=0.99，說明兩種方法之間存在高度相關(guān)性，此結(jié)果說明了本實驗建立的微量法的準確可行性。

3 結(jié)論與討論

本文作者參考國內(nèi)外有關(guān)文獻，充分考慮了影響FRAP法的有關(guān)因素，最后選擇了對其影響較大且報道不一致的三個因素作為考察對象，通過單因素考察得出最佳結(jié)果后進行正交實驗，實驗結(jié)果顯示TPTZ濃度跟有關(guān)報道一致［10-11］，為1倍量的TPTZ溶液(0.3mol/L醋酸鈉緩沖液，10mmol/L TPTZ溶液，20mmol/L氯化鐵溶液三者按照順序體積比為10∶1∶1)，但是對于反應(yīng)時間來說微量法的最佳反應(yīng)時間要比相關(guān)報道長［12-14］，本實驗得出的最佳反應(yīng)時間為40min，這就表示其穩(wěn)定時間較長，而反應(yīng)試劑的最佳加入量為200μL。因此本實驗所建立的總抗氧化能力法FRAP法微量模型為TPTZ工作液由0.3mol/L醋酸鈉緩沖液，10mmol/LTPTZ溶液，20mmol/L氯化鐵溶液三者按照順序體積比為10∶1∶1新鮮配制，在96微孔板中加入10μL樣品和200μL工作液于37℃反應(yīng)40min，于酶標儀上595nm波長處測定吸光度值。

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