竹葉抗氧化物作為大黃魚冷藏保鮮劑的生物學效應研究

姜文進，李 棟，黃駱鐮，吳曉琴，張 英

(浙江大學生物系統工程與食品科學學院，浙江杭州310058)

大黃魚(Pseudosciaenacrocea)為廣溫廣鹽的肉食性魚類，是我國傳統的海產經濟魚類，素有“國魚”之稱。20世紀80年代以來，由于過度捕撈，大黃魚產量急劇下降。20世紀90年代初，大黃魚全人工養殖技術突破后產量逐年上升。同時，由于大黃魚體質較嫩，在運輸過程中，極易導致充血、掉鱗、受傷、耳石中半硅管破裂，死亡率極高。為此，大部分大黃魚以冰鮮原條魚的形式運輸和銷售。目前，冷藏不僅能將魚肉細胞維持在活體狀態，還能有效抑制有害微生物的活動及各種酶的活性，是減緩魚肉腐敗變質和延長貨架期的有效方法。然而，低溫條件并不能完全停止魚的生化反應和抑制有害微生物的繁殖。此外，養殖大黃魚脂肪含量、尤其是不飽和脂肪酸含量較高，冷藏過程中易發生脂肪氧化，影響其貨架期。因此，在冷藏過程中，采用添加外源性的天然物食品添加劑，起到抑菌、保鮮、抗氧化的協同作用，不失為一種方便、經濟、實用的技術手段。竹葉抗氧化物是本課題組創制的、具有本土資源特色和自主知識產權的、安全高效經濟的天然食品抗氧化劑，于2004年4月被批準列入《中華人民共和國食品添加劑使用標準》(GB2760)［1］，現允許使用的范圍包括:食用油脂、油炸堅果與籽類、油炸面制品、即食谷物、焙烤食品、肉制品、水產品、飲料和膨化食品，最大使用量0.5g/kg［2］。已知 AOB具有與茶多酚和 TBHQ等相當的抗氧化效能，兼具抗菌、抑菌、抑制脂質過氧化等多重生物學活性［2-3］。已有研究報道，0.2%的茶多酚(Tea Polyphenol)溶液應用在大黃魚冷藏過程中能有效地抑制細菌繁殖、減緩脂肪氧化［4］，本實驗中作為AOB冷藏保鮮效果的對照。本實驗以竹葉抗氧化物為主要研究對象，通過對竹葉抗氧化物浸泡后的養殖大黃魚冷藏過程中pH、揮發性鹽基氮、質構和K值等指標的變化進行分析，評價其對大黃魚食用品質和貨架壽命的影響，旨在為名優水產品的冷鏈儲運過程中的品質保持提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

養殖大黃魚(活魚)舟山東皇漁業科技發展有限公司提供，為海水網箱激流養殖的閩東族種，平均條重在500～600g之間;竹葉抗氧化物(AOB-Ⅲ)杭州尤美特科技有限公司提供，總酚含量25%，其中異葒草苷含量1.2%;茶多酚 浙江大學茶學系提供，茶多酚含量為85%;殼聚糖(食品級)浙江金殼生物化學有限公司，乙酰化程度為95%;本實驗所用化學試劑 均為分析純;所用水 均為蒸餾水。

KJELTEC 2300全自動定氮儀 瑞典福斯特卡托公司;7530G紫外可見(UV-VIS)分光光度計 上海惠普分析儀器有限公司;AGB5型電子天平(十萬分之一)美國METTLER TOLEDO公司;DELTA pH計 瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司;高效液相色譜儀 美國Waters 2695，配置Waters PDA2996檢測器;TA.XT.plus質構儀 英國Stable Micro System公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 大黃魚處理方式 將運回的鮮活大黃魚試樣采用碎冰凍死后，隨機分成四組，分別為竹葉抗氧化物(AOB)實驗組(0.1%AOB、0.2%AOB水溶液)，陽性對照組(0.2%茶多酚水溶液)和空白對照組(生理鹽水)。各組大黃魚用溶液浸泡15min，取出瀝干后均勻涂抹殼聚糖溶液(1.5%殼聚糖+0.5%冰乙酸+0.5%甘油)，并用蒸煮袋包裝后放置于(4±1)℃冰箱中。樣品從放入冰箱開始，每2d測定一次，至第12d止。

1.2.2 魚肉pH測定 參考Arashisar等［5］的方法，稱取10g全魚肉樣品(沿脊骨剖切，去魚頭、魚尾、魚皮、內臟，取全部魚肉，用組織搗碎機打碎)于燒瓶中，加入煮沸冷卻的蒸餾水100mL，攪勻后用pH計測其上清液pH。

1.2.3 魚肉 K值測定 按照John M Rvder［6］的方法進行大黃魚ATP關聯物的萃取:取5g絞碎均勻的整魚魚肉(同上)于燒杯中，向燒杯中加入25mL冷卻的高氯酸(0.06mol/L)，充分勻漿后，3000r/min下離心10min去沉淀，取上清液10mL，用1mol/L KOH調節pH至6.5～6.8。靜置30min后于3000r/min下離心10min去除沉淀，取10mL上清液在-80℃凍藏用于后期檢測。整個過程均在0～4℃下操作。

大黃魚ATP關聯物的高效液相色譜(HPLC)檢測條件:色譜柱 ODS C18(250mm×4.6mm)，用0.04mol/L KH2PO4、0.06mol/L K2HPO4混和溶液作為流動相進行平衡和梯度洗脫。上樣量為10μL，液相流速為 1mL/min，柱溫為 37℃，紫外檢測器波長為254nm。

K值的計算方法:魚肌肉中ATP按ATP→ADP→AMP→IMP→HxR→Hx途徑降解，其K值計算公式如式(1):

式中，ATP、ADP、AMP、IMP、HxR、Hx 分別代表腺苷三磷酸、腺苷二磷酸、腺苷酸、肌苷酸、次黃嘌呤核苷、次黃嘌呤的濃度(μmol/g，濕基)。K值越小表示鮮度越好，K值越大則鮮度越差。

1.2.4 魚肉中2-硫代巴比妥酸值(TBA)的測定 參考Siu等［7］的TBA測定方法，稱取10g攪碎均勻魚肉(同上)于燒杯中，向燒杯中加入25mL純水，充分勻漿后，再加入5%三氯乙酸(TCA)25mL，充分攪拌均勻，靜止30min，過濾，再用5%三氯乙酸將濾液定容至50mL。取5mL上清液于比色管中，然后向比色管中加入5mL的TBA溶液(0.02mol/L)。將上述混合液在(80±1)℃的恒溫水浴加熱40min，之后冷卻至室溫后，在532nm下測定吸光度。TBA值用丙二醛的質量分數表示，單位為mg/kg。TBA值單位為mg丙二醛/kg樣品。

1.2.5 魚肉中揮發性鹽基氮(TVB-N)含量的測定按照SC/T 3032-2007《水產品中揮發性鹽基氮的測定》［8］測定。

1.2.6 背肌的質構分析 測定時取背脊部魚肉，并將魚肉切成:長(7.0±1.0)cm、寬(4.0±1.0)cm、高(1.0±0.2)cm的魚塊，在TPA模式下測定。測定指標包括硬度、彈性和咀嚼性、粘性、膠黏性、內聚性、回復性。TPA模式參數設定參考戴志遠等［9］的方法，測定具體參數為:使用平底柱形探頭p/75(75mm直徑)，測試前速率3mm/s，測試速率1mm/s，測試后速率1mm/s，壓縮程度50%，停留間隔時間5s，負重探頭類型:Auto=5g，數據收集率:200，環境溫度:12～16℃。每個樣品測6次，取平均值。

1.3 數據統計分析

實驗數據采用SPSS 17.0 for windows軟件進行統計學分析。結果用平均值±標準差表示，顯著性檢驗采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，采用LSD方法進行多重比較，以p＜0.05時為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 不同處理的大黃魚魚肉在冷藏過程中pH的變化

對某些水產品，pH可以作為鮮度變化的一項重要參考指標［10］。養殖大黃魚魚肉的初始pH為6.81，在冷藏過程中pH呈先降后升的趨勢。這是因為魚體死后其肌肉中糖原經過糖酵解途徑后產生乳酸等物質，而使其肌肉中pH下降;之后隨著魚肉鮮度下降，肌肉中蛋白質被分解，產生像氨和三甲胺等物質，這些物質多數呈現堿性，這又導致貯藏后期魚肌肉中的pH 逐漸上升［11］。

圖1為不同保鮮劑處理的試樣在冷藏過程中pH的變化。根據空白對照組pH變化情況，冷藏前8d，魚肉以肌肉中糖原酵解產生乳酸為主，實驗組和茶多酚對照組pH均高于空白對照組，AOB組高于對照組，表明AOB能有效抑制糖原酵解，且效果優于茶多酚;8d以后，蛋白質分解產物含量明顯增加，魚肉腐爛明顯，pH直線上升，實驗組和茶多酚對照組pH均低于空白對照組，且0.2%AOB組低于茶多酚對照組，結果表明，AOB具有延緩魚肉腐爛的作用，其保鮮作用優于0.2%茶多酚。

圖1 不同保鮮劑處理的大黃魚魚肉在冷藏過程中pH的變化Fig.1 Changes in pH of different fish samples during cold storage over time

2.2 不同處理的大黃魚魚肉在冷藏過程中TBA值的變化

硫代巴比妥酸值(TBA value)是檢測油脂氧化酸敗的有效方法，被廣泛用于測定脂類食品，特別是肉類和水產品脂肪氧化酸敗的程度，是判斷魚肉脂肪氧化程度的重要指標［12］。不同處理的試樣在冷藏過程中TBA值的變化如圖2所示。

大黃魚魚肉初始的 TBA值為0.024mg/kg，在(4±1)℃的冷藏過程中呈現逐漸上升的趨勢。12d后空白對照組的 TBA值達到了0.304mg/kg，0.1%AOB實驗組為 0.278mg/kg，茶多酚對照組為0.170mg/kg，而0.2%AOB實驗組為0.152mg/kg。前8d，0.2%AOB組的TBA值一直穩定在較低的水平上，其他組并無顯著性差異;8d后，空白對照組和0.1%AOB組的TBA值迅速增長，而茶多酚對照組和0.2%AOB組雖然也有所增長，但仍遠低于空白對照組。從TBA法測定結果分析，不同處理組的抗氧化性能強弱順序依次為:0.2%AOB＞0.2%茶多酚＞0.1%AOB＞空白對照組。可見，以0.2%濃度AOB溶液處理的效果最佳。研究表明，油脂的自動氧化是一個自由基鏈反應，黃酮類化合物可以通過清除自由基，達到抗氧化的效果［13］。

2.3 冷藏過程中魚肉TVB－N值的測定結果分析

揮發性鹽基氮(Total volatile basic nitrogen，TVB-N)主要包括甲胺、二甲胺和三甲胺，它們是蛋白和非蛋白含氮化合物降解的產物［14］。魚死后，隨著蛋白質的分解，三甲胺、二甲胺和氨類增多，產生腐敗氣味，影響魚肉的感官品質和營養價值，TVB-N值是評價魚肉腐敗程度的重要指標［15］。

經過不同保鮮劑處理的試樣的TVB-N值變化如圖3所示。按照SC/T 3101-2010的規定，TVB-N≤13mg/100g屬于一級新鮮度，≤30mg/100g為合格品。養殖大黃魚魚肉初始的 TVB-N值(0d)為10.89mg/100g，為一級新鮮度;2d時，各組都超過了13mg/100g;4d時空白對照組顯著上升，達到29.53mg/100g，而經保鮮劑處理的組變化不大。第6d時，各組的TVB-N值均顯著上升，但仍≤30mg/100g，仍為合格品;到第8d，空白對照組和0.2%AOB實驗組的TVB-N值＞30mg/100g;第10d，只有0.1%AOB組的TVB-N值≤30mg/100g，仍為合格品。從以上TVB-N測定結果分析，各組試樣的抗氧化強弱順序依次為:0.1%AOB＞0.2%茶多酚＞0.2%AOB＞空白對照組，以0.1%的AOB添加量為佳。

圖2 不同處理的大黃魚魚肉在冷藏過程中TBA值隨時間的變化Fig.2 Changes in thiobarbituric acid(TBA)of different fish samples during cold storage over time

圖3 不同處理的大黃魚魚肉在冷藏過程中TVB-N值隨時間的變化Fig.3 Changes in TVB-N value of different fish samples during cold storage over time

2.4 背肌的質構測定結果分析

質構儀質地多面分析(Texture Profile Analysis，TPA)是通過模擬人口腔的咀嚼運動對試樣進行兩次壓縮，采用力學測試方法來模擬質構變化，它可以模擬反映出魚肉硬度、粘附性等參數［16］。硬度表現為人體的觸覺-柔軟或堅硬，使食品達到一定變形所需要的力，食品保持形狀的內部結合力［17］。經過保鮮劑處理和空白對照組大黃魚的硬度變化如表1所示。

不同處理的背肌試樣在冷藏過程中硬度隨時間的變化見表1。各組硬度的初始值第2d時均無顯著差異(p＞0.05);貯藏第4d，0.2%AOB組顯著大于空白對照組(p＜0.05);貯藏第6d，兩實驗組和陽性對照組均顯著大于空白對照組(p＜0.05);貯藏第8d，兩實驗組的硬度顯著大于空白對照組(p＜0.05)，而陽性對照組則跟空白對照組無顯著性差異(p＞0.05);貯藏第10d，兩實驗組的跟空白對照組無顯著差異(p＞0.05)，陽性對照組顯著小于空白對照組(p＜0.05);貯藏第12d，0.1%AOB組顯著低于空白對照組(p＜0.05)，0.2%AOB組和陽性對照組顯著高于空白對照組(p＜0.05)。從整體看，隨著保藏時間的延長，各組的硬度呈逐漸下降趨勢，可能是因為魚肉的腐敗變質導致魚肉的硬度下降。下降幅度0.2%AOB組最小，與陽性對照組相比效果更好。這表明，0.2%的AOB對冷藏期間大黃魚魚肉的硬度有一定的保護效果。

粘附性是下壓一次后將探頭從試樣中拔出所需的能量大小，反映了在咀嚼魚肉時，食品表面與其物體(舌、齒、腭等)粘在一起的力。粘附性參數能夠反映魚肉細胞間結合力大小，細胞間結合力減少，則粘附性值增大［18］。經過保鮮劑處理和對照組養殖大黃魚的粘附性變化如表2所示。

分析組間的粘附性數據，發現各組并無顯著性差異，這說明粘附性并不能作為評判AOB處理對大黃魚品質影響的指標。

表1 不同處理的背肌試樣在冷藏過程中硬度隨時間的變化(g)Table 1 Changes in hardness of the back muscles of different fish samples during cold storage over time(g)

表2 不同處理的背肌試樣在冷藏過程中粘附性隨時間的變化(g·s)Table 2 Changes in adhesion of the back muscles of different fish samples during cold storage over time(g·s)

2.5 魚肉K值的測定結果分析

因在死亡早期，細菌數量較少，但魚體自身的酶仍有活性，魚的早期鮮度取決于自身的生物化學反應。K值能反映魚體死后ATP降解反應進行的程度，適合對魚類早期的鮮度作出評定［19］。我國國家標準中雖然尚未采用K值作為鮮度指標，但在一些研究部門和水產品出口的鮮度檢測中已開始利用K值來評價魚肉鮮度。許多學者對K值與魚鮮度的關系進行過研究［20］，利用K值評價大多數魚種的鮮度是比較適宜的，一般認為即殺魚的K值在10%以下，作為生魚片的新鮮魚K值大約在20%以下，20%～40%為二級鮮度，60%～80%為初期腐敗魚［21］。經過保鮮劑處理和對照組養殖大黃魚在冰藏條件下K值的變化如圖4。

圖4 不同處理的大黃魚魚肉在冷藏過程中K值隨時間的變化Fig.4 Changes in K value of different fish samples during cold storage over time

由圖4可知，隨著冷藏天數的增加，K值呈現上升趨勢。冷藏0～4d的K值增加幅度最為明顯，4d后增長較緩慢，到8d后K值再次明顯上升。新鮮魚肉的K值為8.46%，冷藏2d后，除空白對照組，其他組都在20%以下，但接近20%。根據K值評價大黃魚新鮮度，實驗組和對照組大黃魚冷藏2d內仍達到新鮮魚要求，而空白組大黃魚則為二級鮮度。到第4d后，各組K值變化趨于平緩。4～8d內，K值變化不明顯，維持在40%左右，各組魚均達到二級鮮度要求。8d后，空白組大黃魚K值顯著增加，到10d已達62.25%，表明大黃魚開始腐敗。而兩個對照組和實驗組K值變化較小，仍顯著低于60%。從以上K值測定結果分析，AOB和茶多酚均能有效延長大黃魚的貯藏時間，不同保鮮劑處理的效果依次為:0.1%AOB＞0.2%茶多酚＞0.2%AOB＞空白對照組，以0.1%的AOB添加量為最佳。

3 結論

本研究以養殖大黃魚為實驗對象，對竹葉抗氧化物和茶多酚的保鮮效果進行了對比研究，表明二者均能顯著延緩大黃魚在冷藏期間的腐敗變質。采用0.1%的AOB溶液浸漬、輔以1.5%殼聚糖溶液的涂膜處理，可將(4±1)℃冷藏條件下的人工養殖大黃魚的貨架期延長，表明竹葉抗氧化物作為一種天然來源的生物保鮮劑在對產品領域的應用前景廣闊。

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