藍(lán)莓花青素的純化及鎮(zhèn)痛、抗炎藥效學(xué)研究

王 靜，馬養(yǎng)民，逯文靜

(陜西科技大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，教育部輕化工助劑化學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西西安710021)

藍(lán)莓，學(xué)名越橘，杜鵑花科(Ericaceae)越橘屬(Vaccinium Linn.)植物，果實(shí)營(yíng)養(yǎng)豐富，含有維生素、蛋白質(zhì)、花青素及黃酮等多種活性成分，其中花青素含量位居所有水果、蔬菜之首。自然狀態(tài)下，植物體內(nèi)的花青素常與多種單糖結(jié)合形成糖苷，故又稱花青苷。花青素具有抗氧化、抗腫瘤、保護(hù)肝臟、增強(qiáng)視力等多種生理功能。研究表明，花青素安全、低毒，口服45min后可進(jìn)入人體各個(gè)組織器官，具有良好的生物利用度［1-3］。藍(lán)莓果大約含有5種以花青素為母本的花青苷［4］，成分復(fù)雜，對(duì)花青素的純化造成了一定困難;大孔樹(shù)脂吸附法是近年來(lái)花青素純化常用的方法之一。目前，藍(lán)莓花青素的生理活性研究多集中在抗氧化能力的評(píng)估、視力保護(hù)及抗腫瘤等方面，然而鎮(zhèn)痛和抗炎作用的研究卻鮮有報(bào)道。本文比較了2種大孔吸附樹(shù)脂對(duì)花青素的純化效果，并采用小鼠受熱致痛法和二甲苯致小鼠耳廓腫脹法對(duì)純化后的花青素進(jìn)行鎮(zhèn)痛抗炎實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步完善花青素生物活性研究，對(duì)藍(lán)莓食品的開(kāi)發(fā)和深加工以及花青素的衛(wèi)生保健應(yīng)用提供發(fā)展方向。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

藍(lán)莓 2010年采自陜西省寧陜縣;D101樹(shù)脂 山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司;Amberlite XAD-7樹(shù)脂 北京慧德易科技有限責(zé)任公司;95%乙醇、甲醇、鹽酸、二甲苯、乙醚均為市售分析純;三氟乙酸(TFA)Sigma公司;昆明種健康小白鼠(雄性)體重18～25g，清潔級(jí)，第四軍醫(yī)大學(xué)提供，合格證號(hào):SCXK(軍)2007-007。

紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)DR5000 美國(guó)Hach公司;數(shù)控超聲波清洗器KQ2200DE 昆山市超聲儀器有限公司;恒溫水浴鍋R201L 上海申生科技有限公司;干燥箱101-1 上海市實(shí)驗(yàn)儀器總廠;離心機(jī)800B上海安亭科學(xué)儀器廠;酸度計(jì)PB-10 Sartorius公司;電子分析天平BS2202S Sartorius公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 藍(lán)莓花青素的純化 首先進(jìn)行花青素提取，將藍(lán)莓果打碎，酸化的60%乙醇溶液于30℃水浴中超聲提取40min，提取液過(guò)濾，旋轉(zhuǎn)薄膜蒸發(fā)儀減壓濃縮。將浸膏分成兩份，一份用D101樹(shù)脂純化，另一份用Amberlite XAD-7樹(shù)脂純化。

D101樹(shù)脂純化時(shí)，浸膏與樹(shù)脂體積1∶5，濕法裝柱，用乙醇洗脫2～3個(gè)保留體積(BV)至洗脫液無(wú)色透明，再用蒸餾水洗至無(wú)醇味，上樣。樣品反復(fù)吸附3次，每次6～8h，吸附完全后先用蒸餾水淋洗，除去雜質(zhì)，檢查流出液至Molish反應(yīng)為陰性。再分別用20%、40%、60%、95%乙醇梯度洗脫，收集流出液，減壓濃縮，冷凍干燥，測(cè)量其中總花青素含量。(Molish反應(yīng):用于檢測(cè)糖的存在。取試樣于試管中，加α-萘酚試劑數(shù)滴，搖勻后沿試管壁滴加濃硫酸或濃鹽酸，看是否有紫紅色環(huán)。)

浸膏與Amberlite XAD-7樹(shù)脂體積1∶3，濕法裝柱，先用95%乙醇洗脫2～3個(gè)BV，再用蒸餾水洗至無(wú)醇味，上樣，充分吸附后開(kāi)始洗脫。先用含0.01%HCl的蒸餾水淋洗，至水溶液澄清為止。再用含0.1%TFA的甲醇溶液洗脫，收集流出液，減壓濃縮，冷凍干燥后測(cè)量其中總花青素含量。

選取D101樹(shù)脂純化后含量為35%的藍(lán)莓花青素進(jìn)行鎮(zhèn)痛及抗炎藥理活性研究。

1.2.2 總花青素的含量測(cè)定 pH示差法［5］測(cè)定總花青素含量。純化后花青素分別用pH1.0的0.025mol/L氯化鉀緩沖溶液和pH4.5的0.4mol/L乙酸鈉緩沖溶液溶解并稀釋?zhuān)贤?可見(jiàn)分光光度計(jì)分別測(cè)定其在525nm和700nm的吸光值，用式(1)計(jì)算吸光值A(chǔ):

總花青素含量按下式計(jì)算:

其中，A:吸光值，由式(1)計(jì)算得到;M:矢車(chē)菊色素-3-O-葡萄糖苷的相對(duì)分子質(zhì)量(449.2g/mol);DF:稀釋因子;ε:矢車(chē)菊色素-3-O-葡萄糖苷的消光系數(shù)(26900L·cm-1·mol-1);l:比色皿寬度(1cm)。

由花青素的質(zhì)量可以確定花青素的質(zhì)量百分含量。

1.2.3 小鼠尾部受熱甩尾法鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn) 將小鼠尾部約1/3浸入(50±0.5)℃的恒溫水浴中，記錄小鼠自尾部被放入水中起至出現(xiàn)甩尾的時(shí)間(s)，作為小鼠的正常痛閾，剔除正常痛閾小于5s或大于30s的小鼠。選擇合格的雄性昆明小鼠48只，隨機(jī)分成6組，每組8只。以皮下注射方式給藥，空白組注射生理鹽水，其余5組分別注射不同濃度的花青素溶液(給藥量分別為 1、3、10、30、100mg/kg)，編號(hào)為花青素A、B、C、D、E。每組小鼠給藥前重復(fù)測(cè)定2次痛閾，取平均值作為該鼠的基礎(chǔ)痛閾。給藥后10、20、30、40、50、60min測(cè)量小鼠的痛閾，痛閾值超過(guò)60s者按60s計(jì)算，記錄結(jié)果，按下式計(jì)算藥品的痛閾提高率，利用t檢驗(yàn)比較組間差異。

其中，P:痛閾提高率(%);T:給藥后小鼠痛閾(s);T0:給藥前小鼠基礎(chǔ)痛閾(s)。

1.2.4 二甲苯致小鼠耳廓腫脹法抗炎實(shí)驗(yàn) 采用小鼠耳廓腫脹法研究花青素對(duì)二甲苯引起的小鼠耳廓腫脹的抗炎作用。取昆明小鼠70只，隨機(jī)分成7組(a～g組)，每組10只。a組為空白組(生理鹽水)、b～g組分別為花青素 1、3、10、30、50、100mg/kg 劑量組。以上7組分別以皮下注射給予生理鹽水或相應(yīng)劑量的花青素0.01mL/g，每日1次，連續(xù)6日。末次注射后1h，將40μL致炎劑二甲苯均勻涂于各個(gè)小鼠右耳廓致炎，左耳對(duì)照。致炎后1h斷椎處死，沿耳廓基線剪下雙耳，用直徑9mm的打孔器分別在左右兩耳的同一部位打下圓耳片，于分析天平稱重，以左右耳片的重量差作為腫脹度(mg)，計(jì)算每組右耳廓腫脹度，并通過(guò)式4計(jì)算其腫脹抑制率，比較組間差異。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)采用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間比較進(jìn)行單因素方差A(yù)NOVA檢驗(yàn)，重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)采用重復(fù)測(cè)量方差分析，多重比較采用LSD法。

2 結(jié)果與討論

2.1 藍(lán)莓花青素的純化

從表1看出，D101樹(shù)脂的純化效果與洗脫梯度有關(guān)，經(jīng)60%乙醇洗脫，總花青素含量最高，達(dá)到35%;而Amberlite XAD-7樹(shù)脂純化后，花青素含量接近50%，效果較好。

表1 純化后總花青素含量Table 1 The total content anthocyanins after purification

2.2 藍(lán)莓花青素對(duì)小鼠尾部受熱致痛反應(yīng)的影響

花青素各劑量組與空白組比較，均有較顯著性差異。給藥后40min鎮(zhèn)痛效果最為明顯(p＜0.01)，實(shí)驗(yàn)得到10mg/kg劑量的花青素的鎮(zhèn)痛效果最好。

由表3看出，小鼠痛閾提高率不僅與花青素濃度有關(guān)，也與花青素體內(nèi)代謝時(shí)間相關(guān)。

由表3看出，5個(gè)實(shí)驗(yàn)劑量的花青素均具有較好的鎮(zhèn)痛效果，且痛閾提高率隨花青素濃度的增加而呈現(xiàn)出先提高后降低的趨勢(shì)。其中花青素劑量為10mg/kg，給藥40min后痛閾提高率最大，鎮(zhèn)痛效果最好;40min后，鎮(zhèn)痛效果逐漸減弱，但是60min時(shí)仍具有一定鎮(zhèn)痛效果。

2.3 藍(lán)莓花青素對(duì)二甲苯致小鼠耳廓腫脹的影響

不同劑量花青素給藥組對(duì)二甲苯所致小鼠耳廓腫脹均有一定的抑制作用，與空白組相比，均具有顯著性差異，但是花青素各劑量組之間并無(wú)顯著性差異。

表2 花青素對(duì)小鼠尾部受熱致痛反應(yīng)的影響(±s，n=8)Table 2 The effects of heat test on mice after injecting anthocyanins(±s，n=8)

表2 花青素對(duì)小鼠尾部受熱致痛反應(yīng)的影響(±s，n=8)Table 2 The effects of heat test on mice after injecting anthocyanins(±s，n=8)

注:與空白組比較*p＜0.05，＊＊p＜0.01;表4同。

給藥后痛閾(s)組別 劑量(mg·kg-1)±0.4 6.0±0.2花青素A組 1 6.5±0.1 7.2±0.7* 8.0±0.7* 9.0±0.8＊＊ 9.9±1.0＊＊ 7.9±0.6* 7.5±0.5*花青素B組 3 5.8±0.4 6.4±0.4* 7.1±0.5＊＊ 7.8±0.7＊＊ 9.0±0.6＊＊ 7.3±0.5* 6.9±0.7*花青素C組 10 4.0±0.2 6.0±0.5* 8.8±0.2＊＊ 10.5±0.9＊＊11.0±1.2＊＊ 7.3±0.6＊＊ 7.0±0.8*花青素D組 30 4.5±0.7 6.3±0.7* 7.5±0.5* 8.3±0.6* 9.9±0.6＊＊ 6.9±0.5* 6.5±0.4*花青素E組 100 4.8±0.3 6.5±0.4＊＊ 7.1±0.7＊＊ 8.0±0.7* 9.1±0.7＊＊ 7.5±0.6＊＊ 6.2±0.2 10min 20min 30min 40min 50min 60min空白組 - 5.9±0.2 6.0±0.6 6.1±0.8 6.2±0.5 6.0±0.3 6.0基礎(chǔ)痛閾(s)*

表3 花青素對(duì)小鼠尾部受熱致痛反應(yīng)的痛閾提高率Table 3 The improvement of pain threshold on mice after injecting anthocyanins

表4 花青素對(duì)二甲苯所致小鼠耳廓腫脹的影響(±s，n=10)Table 4 The protection of anthocyanins on xylene-induced ear edema in mice(±s，n=10)

表4 花青素對(duì)二甲苯所致小鼠耳廓腫脹的影響(±s，n=10)Table 4 The protection of anthocyanins on xylene-induced ear edema in mice(±s，n=10)

組別 劑量(mg·kg-1)腫脹度(mg)腫脹抑制(%)空白對(duì)照組 a組- 7.2±3.1 -花青素樣品組68.1 b組 1 4.4 ±1.9＊＊ 38.9 c組 3 3.5 ±2.0＊＊ 51.4 d組 10 2.9 ±1.3＊＊ 59.7 e組 30 2.0 ±1.1＊＊ 72.2 f組 50 2.2 ±1.4＊＊ 69.4 g組 100 2.3 ± 1.7＊＊

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，花青素能夠提高小鼠的痛閾值，抑制由二甲苯所致的小鼠耳廓腫脹，可能與花青素屬于小分子化合物，易吸收，能穿越血腦屏障，抑制炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生有關(guān)［6］。

3 結(jié)論

3.1 利用兩種大孔樹(shù)脂對(duì)藍(lán)莓果中提取得到的花青素粗品進(jìn)行純化，純化后樣品含量均可達(dá)到國(guó)際入藥要求(＞24%)［7］。經(jīng) Amberlite XAD-7 樹(shù)脂純化得到的花青素樣品含量接近50%，D101樹(shù)脂純化后也可達(dá)到35%。雖然Amberlite XAD-7樹(shù)脂純化效果較好，但價(jià)格昂貴;然而相同浸膏時(shí)D101樹(shù)脂的用量又較大，所以在工業(yè)生產(chǎn)中，應(yīng)根據(jù)實(shí)際生產(chǎn)情況采取經(jīng)濟(jì)、高效的純化路線。

3.2 首次利用從藍(lán)莓果中提取并純化的花青素進(jìn)行鎮(zhèn)痛及抗炎作用研究。具體實(shí)驗(yàn)采用小鼠受熱致痛法和小鼠二甲苯致耳廓發(fā)炎法，結(jié)果表明藍(lán)莓花青素可明顯提高小鼠的痛閾值并抑制耳廓腫脹，且效果良好。本研究不僅證實(shí)了藍(lán)莓花青素的鎮(zhèn)痛、抗炎生理活性，豐富了藍(lán)莓作為天然植物的藥用保健價(jià)值，為藍(lán)莓食品的開(kāi)發(fā)和深加工提供發(fā)展思路，更為花青素資源的進(jìn)一步研究、利用提供了理論基礎(chǔ)。

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