菜豆抗炭疽病苗期鑒定條件優化及種質資源抗性鑒定

韓啟厚 古 瑜 于海龍 夏俊峰 劉惠靜 岳 欣 郎 朗

（天津科潤蔬菜研究所，天津 300384）

菜豆炭疽病是由菜豆炭疽菌〔Colletotrichum lindemuthianum（Sacc. et Magn.）Br. et Cav.〕引起的一種真菌性病害，可侵染菜豆葉片、莖稈及豆莢等。感病品種一旦發病，減產在20%～30%；當溫度（13～26 ℃）和濕度適宜的情況下，減產可達到100%（王坤 等，2008）。

我國是世界上菜豆主產國之一，食莢菜豆產量居世界第一，籽用菜豆產量列世界第三（張子君 等，2002）。現階段菜豆生產上防治炭疽病主要采用化學藥劑防治，不僅耗費人力、物力，而且造成嚴重的環境污染。選育抗炭疽病菜豆品種是防治菜豆炭疽病經濟實用，也是最根本的措施。選育抗病品種，首先要有抗病資源，苗期接種鑒定方法是篩選抗病資源、鑒定抗病品種最有效的方法（Inglis et al.，1988）。

目前，對菜豆抗炭疽病苗期接種鑒定方法也有不少報道，但在實際操作中由于環境條件的差異，現有的鑒定方法主要存在以下問題：① 接種操作方法不統一，接種菌液濃度差異大（濃度差異在幾倍，甚至十幾倍），易產生誤差（馮國軍 等，2008；李梅，2009）；② 對環境條件要求高（多采用恒溫箱控溫、控濕）（馮國軍 等，2008），不容易達到要求，不利于大批量資源鑒定。本試驗結合前人鑒定方法及實際操作過程中存在的問題，對菜豆炭疽病苗期接種鑒定方法進行改良；在溫室加小拱棚的條件下，利用優化的方法對23份菜豆資源進行苗期抗炭疽病接種鑒定，檢驗新方法實用性的同時了解菜豆種質資源的抗性。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試菌種：我國流行的毒力型炭疽病81號生理小種（編號Cll-07），由中國農業科學院作物研究所王曉鳴研究員提供。供試材料：改良接種鑒定方法所用感病材料為雙豐2號。鑒定材料：共23份，包括雙豐類型4份、架豆王類型3份、紅花豆類型2份、九粒白類型3份、油豆類型7份、地豆類型4份。

菌種擴繁：首先將菌種接種于PDA斜面培養基（方中達，1998）（馬鈴薯20 g、葡萄糖15g、瓊脂粉20 g、水1000mL）上，放于20 ℃恒溫培養箱中黑暗培養，使其產生大量菌絲，活化病原菌，然后將PDA斜面培養基上產生的菌絲接種到產孢培養基上，恒溫20 ℃條件下黑暗培養。接種時用無菌水沖下產孢培養基上的孢子，濾除菌絲，配制成一定濃度的孢子懸濁液，懸濁液孢子濃度采用血球計數板計數。

接種條件：接種在加溫溫室內進行，接菌方法采用毛筆涂抹法，接種后在幼苗上方支一小拱棚，接菌后每天噴霧保濕，始終保證幼苗葉片有細小的水霧，控制拱棚內溫度在20～25 ℃，空氣濕度80%～100%。

1.2 試驗方法

1.2.1 產孢培養基及培養時間篩選 采用3種產孢培養基，分別為MA培養基（葡萄糖2.80 g、硫酸鎂1.23g、磷酸二氫鉀2.72 g、蛋白胨1.00 g、瓊脂20 g、蒸餾水1000mL）、豆葉汁培養基（MA培養基+200 g鮮豆葉榨汁）和豆莢培養基（MA培養基+200 g鮮豆莢）。將3種滅菌后的液態培養基倒入直徑為90mm的培養皿中，培養基厚度0.3mm左右。待培養基凝固后，從長滿炭疽病菌絲的PDA培養基上切取0.5mm見方的菌塊，轉接到產孢培養基上，每個培養皿轉接1塊，蓋好培養皿并用封口膜封好。整個過程在超凈工作臺內完成。接種好的培養皿放置在恒溫培養箱內黑暗培養，培養溫度為20 ℃。

培養時間設置10、20、30、40d 4個處理，每個處理接上述3種不同培養基各3皿，3次重復。取孢子時，向長滿菌絲的培養皿內加入5mL滅菌水，用毛筆輕輕刷下培養基表面的孢子，紗布過濾后用血球計數板測定孢子數量。

1.2.2 接種菌菌液濃度篩選 接種菌菌液濃度設3個處理，分別為1.0×106、2.0×106、3.0×106個·mL-1的孢子懸濁液，均勻涂抹到兩葉一心的菜豆幼苗第1片真葉上，每個處理5株，3次重復，共45株。分別在接種后5、7d調查發病情況。

1.2.3 病原菌培養時間篩選 當菜豆幼苗兩葉一心時，分別將培養了10、20、30d的病原菌配成菌液濃度為2.0×106個·mL-1的孢子懸濁液，均勻地涂抹在第1片真葉上，每個處理4株，3次重復，共36株。接菌后分別于5、7d調查發病情況。

1.2.4 接種位置篩選 當菜豆幼苗兩葉一心時，配制濃度為2.0×106個·mL-1的孢子懸濁液，均勻涂抹在第1片真葉上，設正面、背面、正面+背面3個處理，每個處理5株，3次重復，共45株。分別在接種后5、7d調查發病情況。

1.2.5 菜豆種質資源苗期炭疽病抗性鑒定 根據上述試驗得到的菜豆苗期炭疽病接種的優化方法，以雙豐2號為感病對照（CK），對所收集的23份菜豆種質資源進行苗期炭疽病抗性評價，每份材料15株，不設重復。

菜豆單株抗感分級標準和抗性評價標準參照古瑜等（2011）的方法。共分為9級：0級，葉片上無病斑；1級，葉片上有零星點狀病斑；3級，葉片上病斑較小，長1～2mm；5級，葉片上病斑較大，長2.1～5.0mm；7級，病斑大，長5.1mm以上；9級，病斑多數相連，葉片萎蔫。抗性評價根據病情指數來進行劃分：高抗（HR），病情指數范圍0～25.0；中抗（MR），病情指數范圍25.1～50.0；中感（MS），病情指數范圍50.1～75.0；高感（HS），病情指數范圍75.1～100.0。

1.3 數據分析

試驗數據采用DPS軟件進行方差分析，采用Duncans’s新復極差值法進行顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 培養基配方和培養時間對菜豆炭疽菌產孢數量的影響

如表1所示，3種培養基產孢數量在培養40d內都呈現先升高后降低的趨勢，在30d時均達到最高峰，其中豆莢培養基的變化幅度最大。培養10d后，3種培養基產孢數量差異不顯著，但以豆莢培養基產孢數量最多；培養20、30、40d后，豆莢培養基的產孢數量均極顯著高于MA培養基和豆葉汁培養基，分別是MA培養基和豆葉汁培養基產孢數量的14.88、73.69倍，17.87、42.02倍和23.65、99.48倍，而MA培養基和豆葉汁培養基的產孢數量差異均不顯著。

表1 不同培養基和培養時間對菜豆炭疽菌產孢數量的影響

2.2 菌液濃度對菜豆炭疽病發病情況的影響

如表2所示，接種第5天時，菌液濃度分別為 2.0×106個·mL-1和 3.0×106個·mL-1的處理菜豆幼苗炭疽病病情指數差異不顯著，但顯著高于1.0×106個·mL-1的處理。可見，菌液濃度低，幼苗發病速度慢，可能是由于菌液中孢子數量不足造成的；而菌液濃度較高時，孢子從氣孔進入葉片組織，由于氣孔數量有限，多余的孢子不能順利進入葉片組織，也就喪失了致病能力。因此，本試驗認為接種菌液的最佳濃度為2.0×106個·mL-1。

表2 接種菌菌液濃度對菜豆炭疽病發病情況的影響

2.3 菌種培養時間對菜豆炭疽病發病情況的影響

如表3所示，隨著菌種培養時間的延長，菜豆幼苗炭疽病病情指數先升高后下降，接種培養20d菌種的菜豆幼苗炭疽病病情指數為67.86，極顯著高于接種培養10d和30d的處理。可見，菌種培養時間不能太短，亦不能過長，時間過長培養基的營養不能滿足孢子的生長，而使部分孢子侵染能力下降，因此接種應選擇培養時間在20d左右的菌種，菜豆幼苗炭疽病發病效果最好。

2.4 接種位置對菜豆炭疽病發病情況的影響

從表4可以看出，3種接種方法均能使菜豆幼苗葉片感病。接種5d后，背面接種的菜豆幼苗炭疽病病情指數極顯著高于正面接種，背面接種不僅發病速度快，而且效果好于正面接種；背面接種和正面+背面接種的致病效果無顯著差異。接種7d后，3個處理的菜豆幼苗炭疽病病情指數均達到100。可見，炭疽病病菌均能浸染菜豆幼苗葉片正面和背面，而以葉片背面最容易侵入。綜合考慮致病效果及耗時等因素，菜豆幼苗葉片背面為最佳接種位置。

2.5 不同類型菜豆種質資源苗期炭疽病抗性鑒定

從表5可以看出，23份菜豆材料中僅5份材料對菜豆炭疽病有抗性，其中超早三葉紫花架對菜豆炭疽病表現為高抗。5份抗性資源中有4份是油豆類型，1份是地豆類型，栽培區域都比較局限，而栽培面積較廣泛的架豆王類型、紅花豆類型、雙青玉豆類型、九粒白類型的材料均不抗菜豆炭疽病。

表3 菌種培養時間對菜豆炭疽病發病情況的影響

表4 接種位置對菜豆炭疽病發病情況的影響

表5 不同類型菜豆種質資源苗期炭疽病抗性鑒定結果

3 結論與討論

本試驗結果表明：豆莢培養基為最佳產孢培養基，產孢速度最快，可以在短時間內培養出試驗所需的孢子數量；2.0×106個·mL-1為最佳菌液濃度，菜豆幼苗炭疽病病情指數最高；20d為最佳產孢培養時間，產孢數量多，侵染能力強；葉片背面為最佳接種位置，接種鑒定效果最好。

豆莢培養基產孢效果好，可能是由于豆莢中含有大量利于菌種生長所需的營養物質，有利于孢子的產生，產孢數量多而且快，這與李梅（2009）試驗的結果相同。接種濃度是抗病性鑒定的關鍵，國外多采用 1.0×106～10.0×106個·mL-1（Fernandez et al.，2000；Celeste，2006），但以1.2×106個·mL-1居多，而國內接種濃度基本在0.5×106～3.0×106個·mL-1（梁燕 等，1992；馮國軍 等，2008；李梅，2009；張婷 等，2012） 之間，主要是由于接種環境條件不同，導致接種濃度存在差異。del Río等（2003）在進行接種鑒定時將孢子懸浮液噴霧在葉片背面，接種效果較理想。本試驗結果證實了接種菜豆葉片背面發病效果要好于正面，主要是炭疽病病原菌孢子主要經過氣孔侵入葉片細胞，而葉片背面氣孔數量要多于葉片正面，因而染病效果更加明顯。菌種培養時間也是影響病菌致病力的重要因素之一。菌種培養時間過短或過長，侵染效果均不佳，本試驗結果與李梅（2009）的試驗結果基本一致，菌種培養時間20d為宜。接種方法多采用高壓噴霧或普通噴霧器噴霧（張子君 等，2002；王坤 等，2008），所需菌液較多，不僅浪費而且容易造成二次污染，改為毛筆涂抹，可以節約菌液，定量接種。本試驗優化了菜豆苗期接種鑒定方法，在保證接種效果穩定、可重復性強的前提下，簡化了操作步驟，減少了誤差；利用簡單工具，降低成本，提高了效率。可應用于大批量種質資源苗期炭疽病抗性鑒定，但苗期只是菜豆生長的一個階段，隨著菜豆的生長，其對炭疽病的抗性是否會出現變化，成株期植株本身或豆莢是否對炭疽病具有同樣的抗性，還需要做進一步研究。

架豆王類型、雙豐類型、九粒白類型等國內主栽的菜豆品種，對菜豆炭疽病81號生理小種均不具有抗性，一旦氣候條件適合，將造成嚴重的經濟損失。油豆類型和地豆類型資源中有部分品種對81號生理小種表現為抗病，有的甚至免疫，這為菜豆抗炭疽病育種提供了很好的雜交親本。81號生理小種是國內主要流行的菜豆炭疽病生理小種，但也不能忽視對其他生理小種的研究，因此今后還應該密切關注國內菜豆炭疽病生理小種變異情況，并廣泛收集國內外種質資源，以期通過雜交及轉基因等手段培育出抗多個菜豆炭疽病生理小種的菜豆品種。

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