長期酒精暴露對秀麗隱桿線蟲生殖能力的損傷作用研究

李乃鵬 梁瓊麟 羅國安 孟憲生▲.遼寧中醫(yī)藥大學藥學院，遼寧大連 6600；.清華大學化學系，北京 00084

我國是酒的發(fā)源地，擁有悠久的釀酒歷史和豐富的酒文化，尤其在生活和工作節(jié)奏日益加快的當今社會，酒更是成為人們生活中必不可少的一種飲品。然而大量的事實表明，大量飲酒會引起酒精急性中毒，甚至危及生命；長期飲酒可以引起酒精慢性中毒，對機體造成嚴重的損傷并引發(fā)一系列的疾病，如長期大量飲酒可能會對人類生殖系統(tǒng)造成一定的損傷。有研究發(fā)現(xiàn)，酒精對小鼠精子數(shù)量和質(zhì)量也有比較明顯的毒性作用[1-2]，長期酒精暴露會導(dǎo)致后代發(fā)育和運動異常[3]；酒精可以迅速通過胎盤[4]，影響胚胎和母體間的物質(zhì)吸收、利用和轉(zhuǎn)運[5]，間接地損害胚胎進而對后代的生長發(fā)育造成影響。但長期大量飲酒，尤其從幼年時期開始酗酒對人類生殖系統(tǒng)造成的影響，目前研究尚不完善。

為正確認識酒精對人類生育的損傷，提高人類生育質(zhì)量，對酒精生殖毒性的系統(tǒng)研究具有深遠的意義。然而利用人類自身進行酒精生殖毒性系統(tǒng)研究的可行性不大，而利用鼠、猴等實驗動物進行研究，存在實驗成本高、周期長、可選用實驗參數(shù)少、實驗操作復(fù)雜等缺點。

秀麗線蟲是一種優(yōu)秀的模式生物。該模式生物具有體積小、身體透明度高、繁殖速度快、生命周期短、遺傳背景清晰等諸多優(yōu)點，更適合在實驗室中大量培養(yǎng)。秀麗線蟲對外界環(huán)境的變化也非常敏感，環(huán)境因子的微小變化都可能引起秀麗線蟲一系列身體特性的改變，因此，它們常被用作毒理學與環(huán)境暴露安全性評價的重要動物模型[6-7]。本文以秀麗線蟲為實驗生物，對酒精的生殖毒性進行評價，研究不同濃度酒精的長期刺激對秀麗線蟲生殖能力的影響，并觀察這種毒性對子代線蟲運動能力造成的影響，為酒精生殖毒性的系統(tǒng)研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑、儀器和線蟲品系

乙醇（C6H5OH），北京現(xiàn)代東方精細化學品有限公司。Olympus IX71倒置熒光顯微鏡，日本奧林巴斯株式會社。Hettich MIKRO 22R高速冷凍離心機 德國Hettich公司。Sanyo MCO 175 CO2培養(yǎng)箱 日本Sanyo電器集團。秀麗線蟲品系為野生型N2，清華大學醫(yī)學院薛定教授惠贈。

1.2 線蟲的培養(yǎng)和同期化處理

秀麗線蟲培養(yǎng)在涂有大腸埃希菌OP50的瓊脂培養(yǎng)基（NGM）上[8]，到達產(chǎn)卵期后，將線蟲用 20%次氯酸鈉和0.5 mol/L的氫氧化鈉處理，經(jīng)反復(fù)洗滌離心后在M9緩沖液中孵化，即獲得同期化的線蟲。將同期化的線蟲接種在NGM培養(yǎng)基上，20℃下培養(yǎng)。實驗分為分別含有1%、2%、3%、4%、5%酒精的實驗組和不含酒精的空白對照組。

1.3 后代數(shù)目測定

方法參考Swain SC等[9]的報道，隨機挑取L4期線蟲到實驗組和對照組的NGM培養(yǎng)基上，每個培養(yǎng)基1條，20℃下培養(yǎng)，每隔12小時轉(zhuǎn)板一次，將線蟲挑至新的含有對應(yīng)濃度酒精的NGM培養(yǎng)基上，直到產(chǎn)卵期結(jié)束，統(tǒng)計每塊NGM培養(yǎng)基上后代的數(shù)目。

1.4 子宮內(nèi)受精卵數(shù)目測定

將同期化的線蟲分別接種在實驗組和對照組的NGM培養(yǎng)基上，線蟲進入產(chǎn)卵期后，隨即挑取線蟲至無OP50的NGM培養(yǎng)基上，滴加新配制的線蟲裂解液到蟲體，待蟲體被裂解，體內(nèi)受精卵暴露，顯微鏡下觀察，統(tǒng)計受精卵的數(shù)目[10]。

1.5 單側(cè)性腺臂卵母細胞數(shù)目測定

將同期化的線蟲分別接種在實驗組和對照組的NGM培養(yǎng)基上，產(chǎn)卵期結(jié)束后，隨機挑取線蟲至載玻片上，滴加NaN3溶液至蟲體，蓋上蓋玻片，顯微鏡下觀察，統(tǒng)計線蟲單側(cè)性腺臂遠端loop區(qū)到性腺臂近端納精囊之間卵母細胞的數(shù)目[11]。

1.6 排卵速率測定

方法同1.3后代數(shù)目測定，隨機挑取L4期線蟲到實驗組和對照組的NGM培養(yǎng)基上，每個培養(yǎng)基1條，20℃下培養(yǎng)，每12小時轉(zhuǎn)板一次，排除首次和末次NGM培養(yǎng)基上后代，計算排卵過程中線蟲的平均排卵速率。

1.7 子代線蟲頭部擺動頻率測定

頭部擺動頻率 （thrashes）的測定主要參照Tsalik ET和Hobert O[12]的方法，將實驗組和對照組的子代L4期線蟲分別挑至不含酒精和OP50的NGM培養(yǎng)基上，顯微鏡下觀察，統(tǒng)計1min內(nèi)線蟲頭部擺動次數(shù)。

1.8 子代線蟲身體彎曲頻率測定

身體彎曲頻率（body bends）的測定主要參照Tsalik EL和Hobert O[12]的方法，將實驗組和對照組的子代L4期線蟲分別挑至不含酒精和OP50的NGM培養(yǎng)基上，顯微鏡下觀察，統(tǒng)計1min內(nèi)線蟲身體彎曲次數(shù)。

1.9 統(tǒng)計學分析

采用Microsoft office Excel 2003軟件，數(shù)據(jù)以x±s表示，并且用配對t檢驗法對數(shù)據(jù)進行組間差異統(tǒng)計學分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 長期暴露在不同濃度酒精條件下線蟲后代數(shù)目的改變

與對照組相比，長期暴露在酒精濃度為1%條件下，線蟲的后代數(shù)目無顯著性變化，2%、3%、4%、5%條件下線蟲后代數(shù)目明顯降低（P<0.05），見圖1。

圖1 長期暴露在不同濃度酒精條件下線蟲的后代數(shù)目

2.2 長期暴露在不同濃度酒精條件下線蟲子宮內(nèi)受精卵數(shù)目的改變

與對照組相比，長期暴露在酒精濃度為1%條件下，線蟲子宮內(nèi)受精卵數(shù)目無顯著性變化，2%、3%、4%、5%條件下線蟲子宮內(nèi)受精卵數(shù)目明顯降低（P<0.05），見圖2。

圖2 長期暴露在不同濃度酒精條件下線蟲子宮內(nèi)受精卵數(shù)目

2.3 長期暴露在不同濃度酒精條件下線蟲單側(cè)性腺臂卵母細胞數(shù)目的改變

與對照組相比，長期暴露在酒精濃度為1%條件下，線蟲單側(cè)性腺臂卵母細胞數(shù)目無顯著性變化，2%、3%、4%、5%條件下線蟲單側(cè)性腺臂卵母細胞數(shù)目明顯降低 （P<0.05），見圖 3。

圖3 長期暴露在不同濃度酒精條件下線蟲單側(cè)性腺臂卵母細胞數(shù)目

2.4 長期暴露在不同濃度酒精條件下線蟲排卵速率的改變

與對照組相比，長期暴露在酒精濃度為1%、2%條件下，線蟲的排卵速率無顯著性變化，3%、4%、5%條件下線蟲的排卵速率明顯降低（P<0.05），見圖4。

圖4 長期暴露在不同濃度酒精條件下線蟲的排卵速率

2.5 長期暴露在不同濃度酒精條件下產(chǎn)生并孵化的子代線蟲的頭部擺動頻率的改變

與對照組相比，各實驗組的子代線蟲的頭部擺動頻率均有明顯降低（P<0.05），見圖 5。

圖5 長期暴露在不同濃度酒精條件下產(chǎn)生并孵化的子代線蟲的頭部擺動頻率

2.6 長期暴露在不同濃度酒精條件下產(chǎn)生并孵化的子代線蟲的身體扭動頻率的改變

與對照組相比，各實驗組的子代線蟲的頭部擺動頻率均有明顯降低（P<0.05），見圖 6。

3 討論

傳統(tǒng)的生殖毒性實驗常選用大鼠、小鼠等嚙齒類哺乳動物，性成熟時間6~8周，妊娠期約3周，哺乳期約3周，每胎產(chǎn)仔約8~10只，繁殖周期長。L4期線蟲約18 h發(fā)育為產(chǎn)卵期成蟲，產(chǎn)卵期約3~4 d，產(chǎn)卵約280~300個。與傳統(tǒng)實驗動物相比，應(yīng)用線蟲進行實驗具有周期短、成本低優(yōu)點等優(yōu)點，在環(huán)境毒性研究方面具有一定的應(yīng)用價值。

本次實驗結(jié)果顯示：秀麗隱桿線蟲長期暴露在濃度分別為2%到5%的酒精中，后代數(shù)目、子宮內(nèi)受精卵的數(shù)目、性腺單側(cè)臂卵母細胞的數(shù)目均有不同幅度的降低，說明酒精對線蟲的生殖功能造成了一定程度的損傷。其中酒精濃度由低到高的各實驗組后代數(shù)目較對照組分別減少了1.8%、3.2%、41.1%、69.1%、75.4%，隨著酒精濃度升高，產(chǎn)卵數(shù)目明顯降低，從宏觀上直接反映了酒精對線蟲生殖系統(tǒng)造成的損傷。

由于本研究使用的是雌雄同體的線蟲，因此線蟲的受精卵是卵子和精子在體內(nèi)通過受精過程產(chǎn)生的。在線蟲正常的生殖過程中，卵母細胞從單側(cè)性腺臂遠端loop區(qū)到性腺臂近端納精囊之間是緊密排列并與體細胞充分接觸，并且由遠及近，體積會逐漸增大[13]，而實驗觀察到，線蟲卵母細胞數(shù)目減少的同時，卵母細胞的大小形態(tài)也發(fā)生了一定程度的變化，導(dǎo)致細胞的排列并不像對照組一樣緊密，而是出現(xiàn)了一定的間隙。有報道表明，卵母細胞的生長主要依靠從性腺粗線區(qū)域向近端性腺延伸的細胞流向其輸送營養(yǎng)物質(zhì)[14]，而細胞間接觸在營養(yǎng)物質(zhì)向卵母細胞傳遞過程中起到一定作用[15]。實驗中觀察到的細胞間隙的出現(xiàn)可能影響到了正常的營養(yǎng)傳輸，從而導(dǎo)致卵母細胞的發(fā)育受到抑制，這也是直接導(dǎo)致子宮內(nèi)受精卵數(shù)目降低的原因之一。

圖6 長期暴露在不同濃度酒精條件下產(chǎn)生并孵化的子代線蟲的身體扭動頻率

實驗結(jié)果同時顯示，酒精濃度由低到高的各組受精卵數(shù)目較對照組分別減少 7.6%、26.6%、41.8%、58.2%、74.7%，卵母細胞數(shù)目較對照組分別減少7.7%、15.4%、15.4%、23.1%、30.8%，受精卵數(shù)目減少趨勢明顯高于卵母細胞數(shù)目減少趨勢。筆者推測酒精可能對線蟲精子的產(chǎn)生也造成了損傷并可能影響到了線蟲的受精過程，從而導(dǎo)致了受精卵數(shù)目的大幅下降。

排卵速率實驗中，濃度分別為3%、4%、5%的實驗組線蟲排卵速率為每小時2.88個、1.78個、1.79個，較對照組有明顯降低，同時我們觀察到個別線蟲母體內(nèi)出現(xiàn)了少量已經(jīng)孵化的幼蟲，這些現(xiàn)象的出現(xiàn)表明較高濃度酒精刺激下的線蟲不能正常的將受精卵排出體外，同時因此筆者推斷酒精對線蟲的排卵功能也會造成一定程度的損傷。

針對子代線蟲運動能力的實驗中，不同濃度實驗組的子代線蟲的頭部擺動速率和身體扭動速率較對照組均有顯著降低，筆者推斷線蟲的運動功能可能也受到了酒精的抑制。但是由于子代線蟲是在孵化后挑至無酒精的NGM培養(yǎng)基上進行實驗，因此不能確定線蟲運動能力的降低是因為酒精在生殖時期對受精卵造成的損傷還是孵化后子代線蟲短期接觸酒精而受到的神經(jīng)抑制，具體機制有待于我們繼續(xù)研究。而且由于線蟲和人類之間存在物種差異以及在量效關(guān)系轉(zhuǎn)化等方面尚不完善，因此結(jié)果的合理外推還需要進行大量的后續(xù)研究。

綜上所述，實驗中線蟲經(jīng)歷了L1~L4的幼蟲期（相當于人的幼年時期）以及產(chǎn)卵期，實現(xiàn)了酒精的長期暴露，而且酒精通過對卵母細胞和受精卵的損傷、對受精作用和排卵功能的抑制等方面降低了線蟲的生殖能力，表明長期酒精暴露對線蟲具有生殖毒性，為研究長期飲酒對人類生殖系統(tǒng)的損傷作用提供了參考。同時線蟲在酒精生殖毒性實驗中體現(xiàn)出的短周期、低成本和高靈敏度等優(yōu)點，也再次驗證了線蟲作為一種模式生物在環(huán)境毒性評價中的應(yīng)用價值。

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