鹽酸氟桂利嗪固體脂質(zhì)納米粒包封率的測(cè)定

楊 棟 王 瑋 張永玲

1.河南省鄭州人民醫(yī)院，河南鄭州 450000；2.河南大學(xué)藥學(xué)院，河南開封 475000

鹽酸氟桂利嗪（flunarizine hydrochloride，F(xiàn)NZ）化學(xué)名為（E）-1-[雙（4-氟苯基）甲基]-4-2（2-丙烯基-3-苯基）-哌嗪二鹽酸鹽。類別：血管擴(kuò)張藥。性狀：本品為白色或類白色結(jié)晶或結(jié)晶性粉末；無(wú)臭；無(wú)味。本品是一種鈣離子通道阻斷劑[1]，能防止因缺血等原因?qū)е碌募?xì)胞內(nèi)病理性鈣超載而造成的細(xì)胞損害，適用于腦動(dòng)脈硬化、腦血栓形成、高血壓所致的腦循環(huán)障礙、腦出血、頭部外傷及其后遺癥。固體脂質(zhì)納米粒（SLN）結(jié)合了聚合物膠束和水包油性脂質(zhì)納米乳的優(yōu)點(diǎn)[2]，同時(shí)避免了這兩種的缺點(diǎn)，因此是一種特別具有潛力的藥物載體[3]。本實(shí)驗(yàn)采用鹽酸氟桂利嗪作為包封對(duì)象，通過(guò)溶劑乳化冷卻固化法制備鹽酸氟桂利嗪固體脂質(zhì)納米粒，以達(dá)到對(duì)腦的靶向作用。對(duì)于載藥固體脂質(zhì)納米粒包封率的測(cè)定，涉及到游離藥物與固體脂質(zhì)納米粒的分離。常見的分離方法主要有透析法﹑離心法和葡聚糖凝膠法等。影響包封率的因素很多，如藥物-類脂比﹑類脂的種類﹑藥物的性質(zhì)及制備方法等[4]。所以包封的藥物不同，固體脂質(zhì)納米粒的種類及所用脂質(zhì)材料不同，適宜采用的測(cè)定方法亦不相同。本次實(shí)驗(yàn)旨在采用這三種常見的分離方法進(jìn)行分離，并從中尋找到對(duì)于鹽酸氟桂利嗪固體脂質(zhì)納米粒及其游離藥物分離的較好方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

0516-1臺(tái)式離心機(jī) （上海醫(yī)療器械有限公司），CL-3型恒溫加熱磁力攪拌器 （鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司），JY92-ⅡN超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) （寧波新芝科技股份有限公司），S-250D超聲波清洗器 （寧波科生儀器廠），P230型高效液相色譜儀（大連依利特公司），EC2000色譜工作站（大連依利特分析儀器有限公司），AT-330柱恒溫箱 （天津奧特賽恩斯儀器有限公司），色譜柱：ODS-C18柱（200 mm×4.6 mm，大連依利特分析儀器有限公司），透析袋（北京科百奧生物科技有限公司）。

1.2 試藥

鹽酸氟桂利嗪 （鄭州康瑞制藥有限公司，批號(hào)：20111002），豆磷脂（上海恒信化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20091115），硬脂酸（浙江日用海鹽化工廠，批號(hào)：20100301），Poloxamer188（南京威爾化工有限公司，批號(hào)：20111107），SephadexG-50（北京瑞達(dá)恒輝科技發(fā)展有限公司，批號(hào)：20091017），甲醇（天津市福晨化學(xué)試劑廠，色譜純）。

2 方法與結(jié)果

2.1 鹽酸氟桂利嗪固體脂質(zhì)納米粒的制備

采用溶劑乳化冷卻固化法制備鹽酸氟桂利嗪固體脂質(zhì)納米粒。將處方量Poloxamer188在（75±3）℃下分散均勻制成水相；在相同溫度下將豆磷脂、鹽酸氟桂利嗪和硬脂酸分別溶解于無(wú)水乙醇和二氯甲烷中，然后將兩者混合均勻成有機(jī)相；將有機(jī)相逐滴加入水相中，此過(guò)程中保持水浴溫度在（75±3）℃及水相的攪拌速度為1 000 r/min。然后在該溫度下將其混合后的溶液濃縮至8 mL，將濃縮液快速加入另一0℃的水相中，然后經(jīng)超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)超聲后即制得分散均勻的鹽酸氟桂利嗪固體脂質(zhì)納米粒混懸液[5]。

2.2 色譜條件

色譜柱：ODS-C18（200 mm×4.6 mm）；流動(dòng)相：甲醇-磷酸鹽緩沖液（取磷酸二氫鉀1.36 g，加水溶解稀釋成1 000 mL，加三乙胺 4 mL，用磷酸調(diào) pH 值至 3.5）（75︰25）[1]；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：253 nm；柱溫：30 ℃，進(jìn)樣量：20 μL。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別精密吸取濃度為20 μg/mL的FNZ貯備液0.05、0.10、0.25、0.50、1.00、1.50、2.00 mL 置 于 10.0 mL 容 量 瓶中，以甲醇定容至刻度，搖勻，得濃度分別為0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、3.0、5.0 μg/mL 的系列溶液。 在“2.2”項(xiàng)色譜條件下分別取上述標(biāo)準(zhǔn)系列溶液20 μL注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖及峰面積。以鹽酸氟桂利嗪峰面積（A）對(duì)鹽酸氟桂利嗪濃度（C）進(jìn)行線性回歸。回歸方程為：A=43.565C+0.5811（r=0.9997）。 即鹽酸氟桂利嗪在 0.1～5.0 μg/mL 范圍內(nèi)，峰面積（A）與測(cè)定濃度（C）呈良好的線性關(guān)系。

2.4 精密度試驗(yàn)

精密量取濃度為20 μg/mL的FNZ貯備液適量，分別用流動(dòng)相稀釋成濃度為1.0、3.0、5.0 μg/mL的溶液，在一天內(nèi)每隔2小時(shí)進(jìn)樣1次，共測(cè)定3次，將測(cè)得的峰面積代入回歸方程計(jì)算，RSD值分別為1.42%、1.83%、0.60%，表明精密度良好。

2.5 加樣回收率試驗(yàn)

精密量取濃度為20 μg/mL的FNZ貯備液適量，分別加入適量的空白SLN，用流動(dòng)相溶解并定容，得到濃度分別為 1.0、3.0、5.0 μg/mL 的溶液，進(jìn)樣 20 μL，將測(cè)得的峰面積代入回歸方程，計(jì)算平均回收率為98.56%，RSD值為1.76。

2.6 鹽酸氟桂利嗪固體脂質(zhì)納米粒包封率的測(cè)定

2.6.1 透析法

精密吸取鹽酸氟桂利嗪固體脂質(zhì)納米粒混懸液2.0 mL，置透析袋中封口，取蒸餾水28 mL做透析袋外液，室溫下透析6 h，達(dá)平衡后取透析袋外液2.0 mL定容至5.0 mL容量瓶中，搖勻[6]。精密吸取 20 μL 溶液，進(jìn)樣，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定游離鹽酸氟桂利嗪濃度，計(jì)為M1；另精密吸取鹽酸氟桂利嗪固體脂質(zhì)納米粒混懸液1.0 mL，用甲醇破乳并定容至10.0 mL容量瓶中，同法測(cè)定鹽酸氟桂利嗪總濃度， 計(jì)為 M2；計(jì)算平均包封率為 76.42%[（M2-M1）/M1×100%]，RSD 值為 1.75%（n=3）。

2.6.2 離心法

（1）精密量取FNZ-SLN混懸液 2.0 mL，15 000 r/min離心30 min，精密量取上清液0.5 mL于5 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，測(cè)FNZ的含量C1。（2）精密吸取0.5 mL的FNZ-SLN混懸液，轉(zhuǎn)入5 mL容量瓶中，加入適量甲醇超聲溶解，用甲醇定容至刻度，用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液測(cè)定FNZ的含量C2[7]。離心法包封率計(jì)算公式如下：包封率（%）=（1－C1/C2）×100%。 由于載藥脂質(zhì)硬脂酸密度與水相近，離心難度大，即使離心較長(zhǎng)時(shí)間后，離心管上清液中仍有白色的FNZ-SLN，不能完全將FNZ-SLN沉降至管底，即很難把FNZ-SLN與游離FNZ分離完全，測(cè)定結(jié)果為 46.37%，RSD 值為 3.26%（n=3）。

2.6.3 葡聚糖凝膠法

2.6.3.1 洗脫曲線的考察 取一定量Sephadex G-50，用30%的乙醇溶脹12 h后，裝入到20 cm×1.0 cm的層析柱中，最終得到柱高為（15.0±0.5）cm的葡聚糖凝膠柱。取空白SLN 2 mL上柱，用30%乙醇洗脫，飽和柱子后，再分別精密吸取FNZ-SLN 0.3 mL上柱，用30%乙醇洗脫，流速1.0 mL/min，每2分鐘分段收集洗脫液，然后把收集到的洗脫液分別加入到10 mL容量瓶中，先用適量甲醇溶解，后用甲醇定容，取20 μL進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，代入線性回歸方程算出濃度，做洗脫曲線[7-8]，如圖1。結(jié)果表明，葡聚糖凝膠柱可將FNZ-SLN和游離藥物完全分開，即此法適合本實(shí)驗(yàn)的要求，所以選用葡聚糖凝膠法作為包封率的測(cè)定方法。

圖1 FNZ-SLN在Sephadex G-50中的洗脫曲線

2.6.3.2 柱回收率測(cè)定 以蒸餾水與30%乙醇溶液作為洗脫液，洗脫飽和過(guò)的柱子的回收率為（93.60±1.85）%。

2.6.3.3 包封率的測(cè)定 精密吸取空白固體脂質(zhì)納米粒混懸液1.0 mL上柱，飽和柱子后，分別精密吸取三批鹽酸氟桂利嗪固體脂質(zhì)納米粒混懸液0.3 mL，按“2.6.3.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行試驗(yàn)，測(cè)定游離藥物濃度；另精密吸取含藥固體脂質(zhì)納米粒混懸液1.0 mL于10.0 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻。按“2.2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定總藥物濃度，計(jì)算包封率。結(jié)果見表1。可以知葡聚糖凝膠法的包封率為（79.20±1.27）%，RSD 值為 1.61%。 由此可以看出 FNZ-SLN使用葡聚糖凝膠法測(cè)定包封率時(shí)，結(jié)果RSD值較小，說(shuō)明該方法較精密，由圖1看出該法的分離度也較好，所以葡聚糖凝膠法比較適合鹽酸氟桂利嗪固體脂質(zhì)納米粒和其游離藥物的分離。3結(jié)論

表1 FNZ-SLN包封率測(cè)定結(jié)果（n=3）

通過(guò)比較透析法、離心法和葡聚糖凝膠法這三種方法，最終選定葡聚糖凝膠法作為鹽酸氟桂利嗪固體脂質(zhì)納米粒與其游離藥物的適宜分離方法，該法相對(duì)于離心法對(duì)儀器設(shè)備的要求較低，且分離效果較好，相對(duì)于透析法則耗時(shí)較短且測(cè)定的結(jié)果較準(zhǔn)確。所以對(duì)于鹽酸氟桂利嗪固體脂質(zhì)納米粒來(lái)說(shuō)，葡聚糖凝膠法是適宜的包封率測(cè)定方法，用該方法測(cè)得其包封率為（79.20±1.27）%。

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