28烷醇對(duì)6-羥基多巴胺致帕金森病大鼠的行為學(xué)作用及其機(jī)制研究①

王濤，喬洪文，劉雁勇，楊楠，紀(jì)超，陳彪，左萍萍

·專題·

28烷醇對(duì)6-羥基多巴胺致帕金森病大鼠的行為學(xué)作用及其機(jī)制研究①

王濤1，喬洪文1，劉雁勇2，楊楠2，紀(jì)超2，陳彪1，左萍萍2

目的 觀察28烷醇對(duì)帕金森病模型大鼠的行為學(xué)改善作用與中腦水平神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)、神經(jīng)生長(zhǎng)因子前體(proNGF)及其各自受體表達(dá)的變化。方法將6-羥基多巴胺(6-OHDA)通過(guò)立體定位儀注入大鼠右側(cè)紋狀體，以28烷醇17.5 mg/kg (低劑量組)、35 mg/kg(中劑量組)、70 mg/kg(高劑量組)進(jìn)行干預(yù)。給藥2周后行阿樸嗎啡誘導(dǎo)的旋轉(zhuǎn)測(cè)試和平衡桿測(cè)試；TUNEL染色檢測(cè)紋狀體內(nèi)的細(xì)胞凋亡情況；Western印跡法檢測(cè)caspase-3、NGF及其受體、proNGF及其受體蛋白表達(dá)情況。結(jié)果與模型組相比，中劑量和高劑量組旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)和平衡桿實(shí)驗(yàn)成績(jī)改善(P＜0.05)；高劑量組紋狀體內(nèi)凋亡小體減少(P＜0.05)，NGF及其受體TrkA表達(dá)增高(P＜0.05)，proNGF及其受體sortilin和p75NTR表達(dá)降低(P＜0.05)，caspase-3表達(dá)減少(P＜0.05)。結(jié)論28烷醇可改善帕金森病大鼠病理行為。其神經(jīng)保護(hù)機(jī)制可能是調(diào)節(jié)NGF介導(dǎo)的細(xì)胞存活通路和proNGF介導(dǎo)的凋亡通路相關(guān)蛋白表達(dá)，進(jìn)而減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡。

帕金森病；神經(jīng)生長(zhǎng)因子；神經(jīng)生長(zhǎng)因子前體；神經(jīng)保護(hù)；凋亡；大鼠

[本文著錄格式]王濤，喬洪文，劉雁勇，等.28烷醇對(duì)6-羥基多巴胺致帕金森病大鼠的行為學(xué)作用及其機(jī)制研究[J].中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐,2013,19(11):1001-1005.

帕金森病是常見的與衰老有關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。根據(jù)我國(guó)的一項(xiàng)調(diào)查，65歲以上人群中，帕金森病的患病率為1.7%[1]，尚未診斷的帕金森病患者大約還有300萬(wàn)～400萬(wàn)。隨著我國(guó)人口老齡化的加劇，帕金森病患者數(shù)也將會(huì)在未來(lái)20年呈急劇上升趨勢(shì)。目前尚無(wú)治愈疾病的有效方法，多巴胺替代療法只能控制運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)的癥狀，但不能阻止病理進(jìn)程。因此，尋求阻止或延緩帕金森病病理進(jìn)程的神經(jīng)保護(hù)治療是帕金森病治療的根本措施[2]。28烷醇是一種從米糠蠟、甘蔗蠟等中提取的天然長(zhǎng)鏈高級(jí)脂肪醇。它可有效降低血清膽固醇水平，抗脂質(zhì)過(guò)氧化，抑制血小板凝聚，抑制血管內(nèi)皮平滑肌細(xì)胞的增生等[3]。初步臨床研究顯示，一定劑量的28烷醇對(duì)帕金森病患者有一定療效[4]。本實(shí)驗(yàn)觀察28烷醇對(duì)帕金森病模型大鼠的行為學(xué)改善作用及其分子學(xué)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

健康Sprague-Dawley大鼠63只，雄性，體重210～220g，鼠齡3個(gè)月，由北京維通利華動(dòng)物公司提供。行為學(xué)測(cè)試無(wú)異常。按照體重從輕到重順序?yàn)閯?dòng)物編號(hào)(1～63號(hào))，利用隨機(jī)數(shù)字表，63只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(n=10)和造模組(n=53)。

1.2 主要試劑和藥品

28烷醇單體由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物所朱海波教授惠贈(zèng)，以含0.5%縮甲基纖維素鈉(CMC)水助溶制成懸浮液。6-羥基多巴胺(6-hydroxydopamine,6-OHDA)、阿樸嗎啡(Apomorphine,APO)：美國(guó)SIGMA公司；兔多克隆抗神經(jīng)生長(zhǎng)因子前體(precursor of nerve growth factor,proNGF)抗體：CHEMICON公司；神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor,NGF)和sortilin抗體：ABCAM公司；p75NTR抗體：UPSTATE公司；兔多抗caspase-3、phospho-TrkA(p-TrkA)及actin抗體：SANTA CRUZ公司；HRP標(biāo)記羊抗兔二抗及SP-9002免疫組化試劑盒：北京中杉金橋公司；TUNEL凋亡試劑盒：美國(guó)羅氏公司。

1.3 方法

1.3.1 帕金森病大鼠模型的制備 造模組大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉50 mg/kg麻醉，顱平位固定于大鼠腦立體定向儀。剪開頭皮并剝離骨膜，確定具體坐標(biāo)并標(biāo)記，用牙科鉆小心鉆透顱骨。根據(jù)Paxinos Watson圖譜，確定右側(cè)紋狀體(CPU)坐標(biāo)，行兩點(diǎn)注射[5]：前囟前0.5 mm，矢狀線旁開2.5 mm，硬膜下5.0 mm；前囟后0.5 mm，矢狀線旁開4.2 mm，硬膜下5.0 mm。兩點(diǎn)各注射6-OHDA 15 μg，3 μl(溶于含0.2%抗壞血酸的生理鹽水)，注射速度1 μl/min，留針10 min，緩慢退針3 min(1 mm/min)。假手術(shù)組用相同方法兩點(diǎn)注射同體積含0.2%抗壞血酸的生理鹽水。術(shù)后模型成功標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)[6]。

1.3.2 帕金森病大鼠模型篩選 術(shù)后第4周開始對(duì)53只造模組大鼠進(jìn)行旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)篩選：阿樸嗎啡0.5 mg/kg頸部皮下注射，觀察行為變化30 min；若大鼠恒定轉(zhuǎn)向健側(cè)，且旋轉(zhuǎn)圈數(shù)＞150 r，每分鐘最大旋轉(zhuǎn)次數(shù)≥7，表示毀損穩(wěn)定，視為造模成功。共40只造模組大鼠成功。

1.3.3 模型大鼠分組及給藥 造模成功的大鼠按旋轉(zhuǎn)圈數(shù)從少到多順序?yàn)閯?dòng)物進(jìn)行編號(hào)(1～40號(hào))，利用隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分為模型組(n=10)、低劑量組(n=10)、中劑量組(n=10)和高劑量組(n=10)。分組后第1天，低、中、高劑量組大鼠分別給予28烷醇17.5 mg/kg、35 mg/kg、70 mg/kg，每天灌胃給藥1次，模型組及假手術(shù)組給等量0.5%CMC水，連續(xù)給藥2周。

1.3.4 行為學(xué)檢測(cè) 給藥2周后，行阿樸嗎啡誘導(dǎo)的旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)和平衡桿試驗(yàn)。

1.3.4.1 阿樸嗎啡誘導(dǎo)旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn) 阿樸嗎啡0.5 mg/kg行大鼠頸部皮下注射，觀察并記錄其在30 min內(nèi)轉(zhuǎn)向健側(cè)的圈數(shù)。

1.3.4.2 平衡桿試驗(yàn)[7]平衡木桿105×4×3 cm，離地80 cm，兩端由木架支撐。木桿的一端為起始區(qū)，長(zhǎng)20 cm，另一端為終點(diǎn)區(qū)，終點(diǎn)區(qū)后接一個(gè)大鼠籠，木桿下有1×1 m、厚12 cm墊子防止大鼠摔傷。

實(shí)驗(yàn)時(shí)，將大鼠放在起始區(qū)，面對(duì)鼠籠方向，開始計(jì)時(shí)。記錄大鼠走過(guò)起始區(qū)的時(shí)間(潛伏期)和大鼠走過(guò)整個(gè)平衡桿的時(shí)間。潛伏期最大允許時(shí)間為1 min，走過(guò)橫桿最大允許時(shí)間為2 min。大鼠先訓(xùn)練3次，然后開始正式實(shí)驗(yàn)。

1.3.5 TUNEL染色 行為學(xué)檢測(cè)后，每組3只大鼠戊巴比妥鈉50 mg/kg深度麻醉，剪開胸腔，暴露心臟，從左心尖處插入灌流針，剪開右心耳。先用PBS灌流，待血液沖洗干凈后改用4%多聚甲醛繼續(xù)灌流約15 min。斷頭取腦，置于4%多聚甲醛中4℃過(guò)夜。15%、20%和30%蔗糖溶液梯度脫水，4℃存放。冰凍切片機(jī)切取冠狀腦片，片厚30 μm，收集于標(biāo)本保護(hù)液中，-20℃保存。TUNEL染色步驟參照羅氏公司提供的產(chǎn)品說(shuō)明書，DAB顯色、干燥封片。每只動(dòng)物取對(duì)應(yīng)部位2張腦片統(tǒng)計(jì)凋亡小體，分析軟件為Image-Pro Plus。

1.3.6 蛋白表達(dá) 行為學(xué)檢測(cè)后，每組取6只大鼠迅速斷頭取腦，在冰面上迅速分離出兩側(cè)紋狀體，-80℃冰箱保存。將各組右側(cè)(患側(cè))紋狀體放在平皿中，加入適量新鮮配制的RIPA裂解液，剪刀剪碎組織塊(冰上操作)；4℃ 3000 g離心5 min；棄上清，預(yù)冷PBS重復(fù)離心洗滌組織沉淀，至液體無(wú)紅色；將組織沉淀轉(zhuǎn)移至玻璃勻漿器，按30 mg組織加入RIPA裂解液10 ml/mg組織，冰上反復(fù)勻漿0.5～l h；4℃ 14,000 g離心15 min，取上清。用Bradford法定量蛋白。Western印跡電泳方法參見文獻(xiàn)[8]。所有Western印跡實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，電泳條帶結(jié)果定量分析采用Alpha-Ease?FC軟件，相對(duì)密度采用靶蛋白/內(nèi)參蛋白(actin)比值表示。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)

在阿樸嗎啡誘導(dǎo)旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)中，模型組動(dòng)物在30 min內(nèi)向健側(cè)旋轉(zhuǎn)的次數(shù)高于假手術(shù)組(P＜0.001)；低劑量組30 min向健側(cè)旋轉(zhuǎn)次數(shù)與模型組無(wú)顯著性差異，而中劑量組及高劑量組30 min內(nèi)旋轉(zhuǎn)次數(shù)均減少(P＜0.05)。在平衡桿試驗(yàn)中，與假手術(shù)組相比，模型組潛伏期和過(guò)桿總時(shí)間均增加(P＜0.05)；給藥2周后，中劑量組和高劑量組的潛伏期和過(guò)桿總時(shí)間較模型組減少(P＜0.05)。見表1。

2.2 TUNEL染色

與假手術(shù)組相比，模型組患側(cè)紋狀體區(qū)多數(shù)區(qū)域出現(xiàn)明顯細(xì)胞核固縮，核內(nèi)染色質(zhì)在局部區(qū)域凝集，致密濃染，凋亡陽(yáng)性細(xì)胞顯著增多(P＜0.001)；與模型組相比，中劑量和高劑量組患側(cè)紋狀體內(nèi)凋亡陽(yáng)性細(xì)胞減少(P＜0.05)。見圖1、表2。

表1 各組行為學(xué)指標(biāo)比較

表2 各組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較(/mm2)

圖1 各組紋狀體TUNEL染色

2.3 蛋白表達(dá)

模型組凋亡相關(guān)蛋白caspase-3表達(dá)明顯高于假手術(shù)組(P＜0.01)，高劑量組低于模型組(P＜0.05)。

模型組介導(dǎo)細(xì)胞存活通路的NGF及其受體TrkA的磷酸化(活化)水平明顯低于假手術(shù)組(P＜0.01)，介導(dǎo)細(xì)胞凋亡通路的proNGF及其受體sortilin及p75NTR高于假手術(shù)組(P＜0.05)；中劑量組和高劑量組NGF及TrkA表達(dá)高于模型組(P＜0.05)，而proNGF、sortilin和p75NTR表達(dá)低于模型組(P＜0.05)。見表3。

表3 各組紋狀體內(nèi)蛋白表達(dá)相對(duì)光密度(/actin)

3 討論

28烷醇是從植物蠟中提取的天然長(zhǎng)鏈高級(jí)脂肪醇(CH3[CH2]27OH，分子量410.77)，是新型調(diào)脂非處方藥普利醇的主要成分。普利醇作為一種與他汀類不同的降脂藥物，可有效降低血清膽固醇水平，抑制血小板凝聚和血管內(nèi)皮平滑肌細(xì)胞增生等。28烷醇在體內(nèi)吸收分布較快[9]，具有增強(qiáng)體力、精力和耐力，安全性和耐受性好等特點(diǎn)，為帕金森病的臨床治療和干預(yù)提供了新的潛在單體藥物。

本研究使用腦立體定位技術(shù)，將6-OHDA單側(cè)紋狀體兩點(diǎn)注射，構(gòu)建帕金森病大鼠模型。并采用2項(xiàng)帕金森病行為學(xué)指標(biāo)進(jìn)行藥效學(xué)評(píng)價(jià)。①阿樸嗎啡誘導(dǎo)旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)，其原理是多巴胺(DA)神經(jīng)末梢及黑質(zhì)區(qū)的多巴胺神經(jīng)元被6-OHDA選擇性損毀，敏感性增高，出現(xiàn)超敏現(xiàn)象，注射多巴胺受體激動(dòng)劑阿樸嗎啡，可使模型動(dòng)物向健側(cè)產(chǎn)生旋轉(zhuǎn)行為；②平衡桿實(shí)驗(yàn)，包括潛伏期和過(guò)桿總時(shí)間兩項(xiàng)指標(biāo)，分別評(píng)估大鼠的運(yùn)動(dòng)始動(dòng)性和運(yùn)動(dòng)平衡能力[7]。行為學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，帕金森病模型大鼠因患側(cè)黑質(zhì)紋狀體通路受損而致向健側(cè)產(chǎn)生旋轉(zhuǎn)行為次數(shù)明顯增多，運(yùn)動(dòng)始動(dòng)性和運(yùn)動(dòng)平衡能力明顯下降，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[7,10]。表明我們建立的帕金森病大鼠模型可靠。連續(xù)給予28烷醇2周后，中劑量組和高劑量組行為學(xué)指標(biāo)均有明顯改善，說(shuō)明28烷醇可以改善模型大鼠的運(yùn)動(dòng)功能，具有較好的抗帕金森病藥效。

NGF是最早被發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子類物質(zhì)，對(duì)維持神經(jīng)元的存活、生長(zhǎng)、分化以及神經(jīng)損傷后的修復(fù)與神經(jīng)元再生有十分重要的作用[11-12]。NGF與其高親和受體TrkA結(jié)合于細(xì)胞表面后，TrkA磷酸化，形成二聚體。活化的TrkA可介導(dǎo)磷脂酰肌醇-3激酶(PI3-K)/Akt信號(hào)通路。激活的Akt通過(guò)磷酸化與胞漿和核中其他信號(hào)因子相互作用來(lái)促進(jìn)細(xì)胞存活并抑制凋亡[13]。

proNGF為NGF前體形式，它可促進(jìn)NGF的折疊和調(diào)節(jié)分泌，并根據(jù)需要在胞內(nèi)被蛋白酶水解裂解成NGF；另一面，proNGF與受體p75NTR和sortilin結(jié)合，并以高親和性形成雜合三聚體，啟動(dòng)下游凋亡通路，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞死亡[14]。

本研究采用Western印跡法檢測(cè)帕金森病模型大鼠患側(cè)紋狀體內(nèi)的NGF-TrkA蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，模型組NGF和p-TrkA蛋白表達(dá)均降低，提示6-OHDA神經(jīng)毒性對(duì)大鼠腦內(nèi)NGF介導(dǎo)的細(xì)胞存活通路有明顯抑制作用；TUNEL染色顯示模型大鼠患側(cè)紋狀體內(nèi)出現(xiàn)大量凋亡陽(yáng)性細(xì)胞，推測(cè)由于NGF細(xì)胞存活信號(hào)通路受到抑制，導(dǎo)致紋狀體內(nèi)出現(xiàn)大量神經(jīng)細(xì)胞凋亡；模型組凋亡相關(guān)蛋白caspase-3表達(dá)水平升高也證實(shí)了這一點(diǎn)。

本研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，中高劑量28烷醇治療可以減少紋狀體內(nèi)細(xì)胞凋亡，NGF、p-TrkA蛋白表達(dá)有不同程度上升，對(duì)抗6-OHDA的神經(jīng)毒性作用。

近年來(lái)，較多文獻(xiàn)認(rèn)為神經(jīng)細(xì)胞生存或死亡取決于NGF和proNGF的平衡[15-17]。Western印跡結(jié)果顯示，模型組大鼠紋狀體proNGF及下游復(fù)合受體sortilin/p75NTR蛋白表達(dá)均增高，提示6-OHDA神經(jīng)毒性可明顯提高proNGF及其復(fù)合受體sortilin/p75NTR蛋白表達(dá)，激活下游細(xì)胞凋亡信號(hào)通路，這與我們?cè)赥UNEL染色和caspase-3蛋白電泳實(shí)驗(yàn)中觀察到的結(jié)果一致。高劑量28烷醇可逆轉(zhuǎn)介導(dǎo)凋亡信號(hào)通路的proNGF及其受體sortilin/p75NTR及下游凋亡蛋白caspase-3的過(guò)表達(dá)。

綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，神經(jīng)毒素6-OHDA下調(diào)NGF及TrkA蛋白表達(dá)，同時(shí)上調(diào)proNGF-sortilin/p75NTR蛋白表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡；而不同劑量28烷醇通過(guò)調(diào)節(jié)proNGF介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡通路和NGF介導(dǎo)的細(xì)胞存活通路，可以部分逆轉(zhuǎn)上述促凋亡效應(yīng)。

目前國(guó)內(nèi)對(duì)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)類因子的多數(shù)研究只局限于對(duì)單一信號(hào)通路的觀察。例如，對(duì)NGF的神經(jīng)保護(hù)研究大多只圍繞著NGF及其介導(dǎo)的下游信號(hào)通路機(jī)制進(jìn)行闡述，忽視了重要的前體形式proNGF及其受體p75NTR/sortilin在腦內(nèi)的變化；神經(jīng)細(xì)胞的存活或凋亡，取決于NGF與proNGF[18]及其受體TrkA和p75NTR/sortilin的對(duì)比，而不是僅取決于NGF介導(dǎo)的細(xì)胞存活通路[15-17]。

本研究闡述28烷醇對(duì)6-OHDA致帕金森病大鼠模型的行為學(xué)改善作用，探討28烷醇的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制與其同時(shí)調(diào)節(jié)NGF介導(dǎo)的細(xì)胞存活通路和proNGF介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡通路相關(guān)。為28烷醇應(yīng)用于抗帕金森病臨床藥物干預(yù)提供了理論依據(jù)。

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Effects of Octacosanol on Behavioral Impairments and Its Mechanism through Nerve Growth Factor Mediated Pathway in Parkinsonism Rats Induced with 6-hydroxydopamine

WANG Tao,QIAO Hong-wen,LIU Yan-yong,et al.Department of Neurobiology,Beijing Institute of Geriatrics,Xuanwu Hospital,Capital Medical University,Beijing 100053,China

ObjectiveTo investigate the effects of octacosanol on the behavioral changes and its potential mechanism in 6-hydroxydopamine-induced Parkinsonism rats.Methods6-hydroxydopamine-induced Parkinsonism rats accepted octacosanol orally in the dosage of 17.5 mg/kg(low dose),35 mg/kg(medium dose)and 70 mg/kg(high dose)for 2 weeks,and then assessed with rotating test and narrow beam test.The apoptosis cells were counted with TUNEL assay,and the expression of nerve growth factor(NGF),precursor of nerve growth factor(proNGF),as well as their receptors were detected with Western blotting.ResultsThe achievement of behavioral tests significantly improved after administration of octacosanol(P＜0.05),with the decrease of the apoptotic cells,more expression of NGF and its receptors TrkA,and less expression of caspase-3,proNGF and its receptors p75NTR and sortilin,especially at the dosage of 70 mg/kg(P＜0.05).ConclusionOctacosanol may protect the neurol impairment from 6-hydroxydopamine through NGF mediated pathway to decrease the apoptosis.

Parkinson's disease;nerve growth factor;precursor of nerve growth factor;neuroprotection;apoptosis;rats

R742.5

A

1006-9771(2013)11-1001-05

2013-06-16

2013-08-12)

1.國(guó)家973基金項(xiàng)目(No.2010CB934002;No.2011CB504101;No.2011CBA00408)；2.國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81050025)；3.神經(jīng)變性病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題(No.2012SJBX01)；4.北京市腦重大疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題(No.2013NZDJ05)。

1.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院神經(jīng)生物學(xué)研究室，北京市100053；2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所藥理室，北京市100730。作者簡(jiǎn)介：王濤(1980-)，男，漢族，遼寧大連市人，博士，助理研究員，主要研究方向：抗帕金森病新藥藥效學(xué)及機(jī)制研究。通訊作者：左萍萍(1950-)，女，湖南長(zhǎng)沙市人，博士，研究員，博士生導(dǎo)師，主要研究方向：神經(jīng)藥理學(xué)。

10.3969/j.issn.1006-9771.2013.11.001