煙草抗PVYN突變株SN01的SRAP-PCR反應體系的建立與優(yōu)化

李 杰，朱 丹，李 穎，安夢楠，趙秀香，吳元華*

（1.沈陽農(nóng)業(yè)大學植物保護學院，沈陽 110866；2.遼寧省撫順市農(nóng)業(yè)技術推廣中心，遼寧 撫順 113006）

Sequence-related amplified polymorphism (SRAP)標記技術是一種新型的基于 PCR的顯性標記系統(tǒng)[1]，該技術利用獨特的雙引物對基因的open reading frames（ORFs）特定區(qū)域進行擴增，與RAPD、SSR、AFLP等技術相比，SRAP技術具有操作簡便、重復性好、信息豐富等優(yōu)點，特別是對序列信息未知的物種研究提供了快捷簡便的途徑。該技術已成功用于一些重要性狀的標記、基因定位、遺傳圖譜的構建和抗病基因相關方面研究[2-8]。

本研究室通過人工接種的方法從煙草品種NC89中篩選獲得了高抗馬鈴薯Y病毒脈壞死株系（Potato virus Y-vein necrosis strain，PVYN）的植株（暫定名為SN01），并對該突變株的抗病生理生化機制進行了報道[9]。采用正交試驗建立優(yōu)化的SRAP-PCR反應體系，為進一步研究其抗病基因奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

抗PVYN煙草突變株SN01的嫩葉于2012年7—9月采自沈陽農(nóng)業(yè)大學植物病毒研究室。用于SRAP-PCR反應的dNTPs、Taq DNA聚合酶、標準分子量（Maker）DL2000及新型植物DNA提取試劑盒均購自北京天根生化科技有限公司，Mg2+溶液和10×PCR buffer（Mg2+free）均購于大連寶生物工程有限公司。SRAP引物由上海生工生物工程公司合成，引物序列見表1。

表1 引物序列Table1 Sequence of primers

1.2 方法

1.2.1 煙草總 DNA的提取和濃度測定 煙草總DNA的提取使用北京天根生化科技有限公司的新型植物DNA提取試劑盒，用美國熱電集團生產(chǎn)的NANODROP 1000核酸檢測儀檢測所提取煙草DNA的濃度與純度，并通過瓊脂糖電泳檢測總DNA純度。將提取到的DNA稀釋至30 ng/μL，置于-20 ℃冰箱保存以備使用。

1.2.2 SRAP-PCR反應體系的正交設計 采用L16(45)正交試驗設計，對SRAP-PCR反應體系里主要的5個影響因素（dNTPs、Mg2+、Taq DNA聚合酶、引物、DNA模板）設計正交優(yōu)化試驗，所用引物為Me8和Em8（表1）。SRAP-PCR各因素的水平見表2，L16(45)正交試驗設計方案見表3。反應總體系為 20 μL，每管加入 2 μL 的 10×PCR buffer（Mg2+free），其他組分加入量見表3，最后用ddH2O補充至 20 μL。

表2 SRAP-PCR反應因素和水平Table2 Factors and levels of SRAP-PCR reaction

表3 SRAP-PCR反應中各因素水平L16(45)正交試驗設計Table3 L16(45) orthogonal design of factors and levels for the SRAP-PCR

1.2.3 SRAP-PCR擴增 按照L16(45)正交試驗設計16個處理，重復2次。根據(jù)表3制備總體積為20 μL的PCR反應體系。反應程序為：94 ℃預變性5 min；前 5 個循環(huán)為 94 ℃變性 45 s，34 ℃退火 45 s，72 ℃延伸1 min；后35個循環(huán)僅將退火溫度變?yōu)?7 ℃；循環(huán)結束后，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。擴增產(chǎn)物用6%聚丙烯酰胺凝膠電泳觀測。

1.2.4 退火溫度及循環(huán)次數(shù)的篩選 在正交試驗的基礎上，對SRAP反應的退火溫度和循環(huán)次數(shù)進行優(yōu)化篩選試驗。退火溫度梯度試驗設計 11個梯度處理，即48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58 ℃。在退火溫度梯度試驗的基礎上，進行了循環(huán)次數(shù)的篩選，設置了9個處理，每個處理重復2次：（1）52 ℃，30循環(huán)；（2）55 ℃，30循環(huán)；（3）57 ℃，30 循環(huán)；（4）52 ℃，35 循環(huán)；（5）55 ℃，35 循環(huán)；（6）57 ℃，35 循環(huán)；（7）52 ℃，40循環(huán)；（8）55 ℃，40循環(huán)；（9）57 ℃，40循環(huán)。

2 結 果

2.1 基因組DNA的提取

基因組提取使用北京天根生化科技有限公司的新型植物DNA提取試劑盒，經(jīng)核酸檢測儀檢驗結果表明，所提取基因組的OD值為1.8～2.0，并且濃度較高。通過瓊脂糖電泳進一步檢測（圖1），點樣孔附近有明顯的亮帶聚集產(chǎn)生，并且沒有拖尾現(xiàn)象，表明所提取的基因組純度較好，質量較高。

2.2 SRAP-PCR反應體系正交設計的優(yōu)化

正交試驗設計按照表3的16個處理進行SRAP-PCR擴增試驗，將得到的擴增產(chǎn)物進行電泳分析（圖2），可以看出處理1、2沒有條帶；處理3、4、5、12、13、14、15、16條帶較少，清晰度較差；處理 8、9、10、11的條帶較多，且亮度和清晰度較好，其中以處理11效果最好。

圖2 正交試驗SRAP-PCR產(chǎn)物電泳結果Fig.2 Electrophoresis results of SRAP - PCR product by orthogonal experiment

參照張麗等[10]的統(tǒng)計方法，對 16個組合正交試驗結果進行分析（表4），從k值結果可以看出，dNTPs以k3最佳，Mg2+以k3最佳，Taq DNA聚合酶也以k3最佳，引物以k2最佳，模板DNA以k4最佳，即dNTPs 0.4 mmol/L，Mg2+2.0 mmol/L，Taq DNA聚合酶0.8 U，引物0.3 mmol/L，模板DNA 120 ng。該結果與處理11相近，僅在Taq DNA聚合酶水平略有差異，從而認為處理11為最佳組合，即20 μL體系中，最佳加入量分別為：dNTPs（2.5 mmol/L）3.2 μL、Mg2+（25 mmol/L）1.6 μL、Taq DNA聚合酶（2.5 U/μL）0.16 μL、引物（10 μmol/L）0.6 μL、DNA模板120 ng。從R值的結果來看，dNTPs對擴增結果影響最大，Taq DNA聚合酶和引物影響次之，模板DNA和Mg2+影響相比較弱。從擴增結果較好的處理8、9、11看，模板DNA的量分別是30、60、120 ng，表明模板DNA的試用范圍較廣。

2.3 退火溫度及循環(huán)次數(shù)

退火溫度梯度試驗設計11個處理即48～58 ℃。從圖3中可以看出，退火溫度的不同對SRAP擴增條帶有較大影響，以處理5（52 ℃）、處理8（55 ℃）和處理10（57 ℃）條帶較亮，其中以處理10擴增條帶豐富，亮度最佳。

表4 SRAP正交試驗結果統(tǒng)計分析Table4 Statistic result of orthogonal experiment

圖3 不同退火溫度對SRAP-PCR產(chǎn)物電泳結果的影響Fig.3 The electrophoresis results of SRAP - PCR product in different annealing temperatures affect

在對退火溫度篩選研究的基礎上，對循環(huán)次數(shù)進行了優(yōu)化篩選，循環(huán)次數(shù)由30次增加到40次，設置9個處理，重復2次。從圖4中可以看出，循環(huán)次數(shù)30次條帶幾乎沒有或者不亮，而在35次和40次時條帶較好。在不同溫度、循環(huán)次數(shù)相同時比較,溫度越高條帶越清晰，且擴增條帶增多。但在相同溫度、不同循環(huán)次數(shù)比較時，30次和40次時條帶較弱或者模糊，35次時條帶較亮且多態(tài)性較好。從整個電泳結果來看，以處理3結果最好，即退火溫度57 ℃，循環(huán)次數(shù)35次。

3 討 論

圖4 同退火溫度和循環(huán)次數(shù)的SRAP-PCR產(chǎn)物電泳結果Fig.4 Electrophoresis results of SRAP-PCR products with different annealing temperatures and cycles

SRAP-PCR的反應體系不僅受到材料差異的影響，而且引物的不同、試驗儀器的不同也會對反應體系造成一定的影響。本試驗中試驗材料為突變株SN01，為研究突變株SN01的抗病基因，通過引物篩選選用條帶清晰且數(shù)量較多的引物組合，并在使用此引物的基礎上，對SRAP-PCR體系進行優(yōu)化。PCR反應體系的合適與否直接影響其擴增的結果，目前對 PCR體系優(yōu)化的方法以正交試驗和單因素設計試驗較多，正交試驗方法可以減少試驗次數(shù)，縮短試驗周期，降低研究成本，可迅速快捷的找到優(yōu)化的方案。單因素試驗可直觀快速地明確各因素對PCR的影響，但忽略了各因素間的相互作用[11]。對于PCR產(chǎn)物電泳結果的分析，主要是直觀法和統(tǒng)計分析法兩種方法評價分析，這兩種方法都有一定的主觀性，在擴增條帶結果統(tǒng)計過程中難免會有人為因素的影響。

在PCR反應中，不同的引物在反應中要求退火溫度也有所不同，退火溫度過高或者過低都會影響到產(chǎn)物的產(chǎn)量或質量，因此本試驗在初步篩選引物后進行了梯度退火實驗，并對循環(huán)次數(shù)進行了篩選，得到了最佳的PCR反應體系。

4 結 論

本研究以煙草抗PVYN突變株SN01為材料，通過正交試驗設計對其SRAP的反應體系進行了優(yōu)化，并且對退火溫度和循環(huán)次數(shù)進行了篩選，得出煙草突變株SN01的SRAP最佳反應體系dNTPs（2.5 mmol/L）3.2 μL、Mg2+（25 mmol/L）1.6 μL、Taq DNA聚合酶（2.5 U/μL）0.16 μL、引物（10 μmol/L）0.6 μL、DNA模板120 ng。SRAP-PCR的最佳反應程序為：94 ℃預變性5 min；前5個循環(huán)為94 ℃變性45 s，34 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min；后35個循環(huán)將退火溫度變?yōu)?7 ℃；循環(huán)結束后，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。該優(yōu)化體系的建立，為進一步對煙草PVYN突變株SN01的抗病基因研究提供了可靠的基礎。

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