陳化煙葉中纖維素降解菌群的分離及其特性研究

關 亮，李天麗，陳竹亭，周亞維，湯朝起，瞿永生，李朋富*

（1.南京大學生命科學院，南京 210093；2.上海煙草集團有限責任公司，上海 200082）

陳化煙葉表面被發現有很多種微生物，其中細菌占絕對優勢，放線菌和霉菌尤其是放線菌數量較少，細菌中優勢種類有芽孢桿菌屬（Bacillus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）和噬菌弧菌屬（Bacteriovorax）等[1-2]。趙銘欽等[3]研究發現，在煙草陳化過程中煙葉表面的微生物種類和數量隨著發酵時間的延伸而呈遞減趨勢，陳化過程中烤煙煙葉中的多酚氧化酶、蛋白酶和α-淀粉酶活性在前期不斷增加，中后期逐漸下降；過氧化物酶活性在陳化期間則一直下降。在煙葉陳化過程中微生物對提高煙葉香氣發揮了重要作用[4-6]。在烤煙人工發酵過程中，應用微生物酶或者接種烤煙表面優勢微生物，可加快發酵進程，明顯提高煙草品質[7-9]。

纖維素是煙葉的主要結構成分，決定著煙葉完整性，可使煙葉持火力增加。但是，煙葉中纖維素含量過高時煙葉組織容易破碎，煙草配方中纖維素含量高對燃吸品質具有副作用，賦予煙氣一種尖刺的刺激性和一種“燒紙”的氣味[10]。為了研究微生物在煙葉陳化過程中的作用，以及利用微生物發酵降低煙葉或煙梗中過高的纖維素含量，以提高煙葉品質，本文從陳化煙葉中分離纖維素降解菌群，并分析其特性。

1 材料與方法

1.1 纖維素降解菌群的分離

2009年河南產B2F等級煙葉（陳化6個月）由上海煙草集團有限責任公司提供。培養基為蛋白胨纖維素培養液（PCS）[11]：蛋白胨 0.5%，濾紙1%，NaCl 0.5%，酵母粉0.1%，CaCO30.5%，pH為8。取60 g煙葉加入500 mL 磷酸緩沖液（PBS）中，搖床200 n/min搖動3 h，然后在超凈臺中用滅菌過的250尼龍篩過濾，濾液在5000 g轉速下離心15 min，將離心所得細菌加入PCS中，30 ℃搖床（160 n/min）培養，待濾紙崩解后，按3∶100的比例轉接到新的PCS培養基中，如此不斷轉接，待濾紙崩解所需時間穩定后即獲得纖維素降解菌群。

1.2 變性梯度凝膠電泳（DGGE）分析菌群組成

PCS培養基中接入菌群后，0～9 d連續取樣1 mL，離心后采用XS方法[12]提取細菌DNA，DNA純化采用EZ-10 Spin Column（上海生物工程有限公司）進行。16S rDNA片段的PCR擴增采用一對通用引物 341F（5′-CCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和518R（5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′）[13]，其中引物 341F的5′端連接著GC發夾結構(5′-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGG GGCACGGGGG G-3′）。

PCR反應條件為：95 ℃預變性5 min，以下為94 ℃ 1 min，65～56 ℃ 30 s（每個循環降 1 ℃，共10個循環），72 ℃ 1 min，后20個循環用55 ℃退火，最后72 ℃延伸10 min。PCR產物用1.2%瓊脂糖電泳檢驗。

DGGE采用CBS電泳裝置（CBS，美國），濃度為 8%的聚丙烯酰胺凝膠，0.5×TAE電泳緩沖液（20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.3，10 mmol/L醋酸，0.5 mmol/L EDTA），40%～60%的變性膠梯度（100%變性劑為7 mol/L尿素和40%去離子甲酰胺的混合物），60 ℃和75V電泳16 h。電泳結束后用Gelred染色，再用凝膠成像儀（720BR-01503，BIO-RAD，美國）拍照。

選擇亮度較高的條帶，用手術刀片切下，放置在1.5 mL聚丙烯離心管中，搗碎，加入30 μL去離子水，4 ℃過夜。取2 μL溶解液作為模板，在相同條件下重復上述PCR過程（341F不加GC夾），將用EZ-10 Spin Column（上海生物工程有限公司）純化后的PCR產物連接到pGEM-T載體中（Promega，美國）并導入感受態細胞進行克隆，再以陽性克隆子為模板，利用引物為T7（5'-GGC CGC GGG AAT TCG ATT-3'）和 SP6（5'-GCG AAT TCA CTA GTG ATT-3'）進行克隆PCR，PCR產物由ABI 3730XL DNA測序儀（上海生工有限公司）測序，測序結果提交到EMBL，所得序列號為HE793381- HE793384和HE793387。

1.3 溫度和pH對菌群纖維素酶活性的影響

酶活性的測定參考孫寶魁的方法[14]。取 1 mL細菌培養液，10000 n/min離心2 min后，取上清液作為酶液。1 mL 0.625%的羧甲基纖維素鈉溶液（pH 5的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液配制)中加酶液 0.5 mL，于50 ℃水浴反應 30 min后，先加入10%的NaOH溶液0.5 mL，再加入1 mL的DNS（3,5-二硝基水楊酸），沸水浴5 min，冷卻后定容至10 mL，在 530 nm下測定其 OD值。空白對照是將酶液100 ℃水浴15 min后，按同樣方法進行分析。采用上述方法制作葡萄糖標準曲線，根據標準曲線上算出酶反應液中的葡萄糖濃度，再根據以下公式計算酶活性。酶活力單位的定義為：1 mL酶液作用于底物每分鐘生成 1 μg葡萄糖所需的酶量為一個酶活（U）。酶活性的計算公式是：

U=CV1/（tV2）

其中：C—酶反應液中葡萄糖濃度（μg/mL），V1—酶反應液體積（mL），V2—所取酶液體積（mL），t—水浴時間（min）。

在分析溫度對纖維素酶活性的影響時，纖維素酶活性測定過程中加入酶液后的水浴溫度為 20、25、30、45、50、55、60和65 ℃。分析pH對混合菌群纖維素酶活性的影響時，纖維素酶活性測定過程中用pH為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0和9.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液配制羧甲基纖維素鈉溶液。

1.4 菌群降解濾紙、煙葉和煙梗過程中纖維素酶活性的變化

以 PCS為基礎培養基，纖維素碳源分別是濾紙、煙葉和煙梗（均為 1%的含量），30 ℃條件下160 n/min搖床培養，定時取樣測定纖維素酶活性。

2 結 果

2.1 纖維素降解菌群的分離

圖1 菌群接入PCS培養基6 d后情況Fig.1 Photograph of bacterial community culture grown in PCS medium for 6 d

經過 12代以上的傳代培養，得到了具有穩定降解纖維素能力的菌群（圖1），該菌群在PCS（加濾紙）培養基中培養6 d左右時，培養基顏色變深，濾紙大部分被降解，培養液顏色變成深黃色，繼續培養4 d后濾紙幾乎全部分解。試圖采用曾濤等[15]的培養基分離能夠降解纖維素的單個細菌，但沒有成功。

2.2 纖維素降解菌群的組成

從DGGE圖譜來看（圖2），在連續9 d的培養過程中纖維素降解菌群組成較為穩定，圖中A-E條帶序列的BLAST結果見表1。

圖2 PCS培養基培養9 d過程中纖維素降解菌群組成的DGGE分析Fig.2 DGGE profile of cellulose-decomposition bacterial community grown in PCS medium for 9 d

表1 DGGE圖中各條帶序列的EMBL序列號及BLAST結果Table1 The EMBL and BLAST result of the bands in DGGE picture

2.3 溫度和pH對菌群纖維素酶活性的影響

從圖3結果來看，20 ℃時酶活性很低，隨著溫度升高酶活性升高，在 60 ℃時纖維素酶活性達到最高值，繼續升高溫度則酶活性下降。從圖4可看出，pH從3升高到8時，纖維素酶活性不斷增大，pH 8的時候酶活性達到最大，但當pH繼續升高到9時則酶活性下降。

2.4 菌群降解濾紙、煙葉和煙梗過程中纖維素酶活性的變化

圖3 溫度對纖維素酶活性的影響Fig.3 Effect of temperature on the cellulase activity

圖4 pH對纖維素酶活性的影響Fig.4 Effect of pH on the cellulase activity

圖5 不同纖維素材料對菌群纖維素酶活性的影響Fig.5 Effect of different cellulose source on the cellulase activity

從圖5結果看出，所得纖維素降解菌群在加入3種纖維素類材料培養過程中均表現出較高的纖維素酶活性，第7天纖維素酶活性達到最大，在加入煙葉、濾紙和煙梗培養時纖維素酶活性分別為最高達111.07、53.88和50.87 U，加入煙葉培養菌群時纖維素酶活性最高。

3 討 論

本實驗中分離纖維素降解菌群時，除了采用PCS培養基外，還采用了羧甲基纖維素鈉培養基[15]，兩種培養基分離菌群時各進行了3次重復，都成功地獲得了降解纖維素的菌群，但只對其中一個在PCS培養基中獲得的菌群進行了繼續分析。具有纖維素降解活性菌群的成功分離顯示，在陳化過程中微生物可能參與了煙葉纖維素的降解。

從DGGE分析的菌群組成看，條帶A為節桿菌屬的一種細菌，在接種纖維素降解菌的堆肥發酵中，也檢測到了節桿菌[16]。條帶B為放線菌屬的未培養菌，放線菌可以降解利用含有木質素、纖維素、半纖維素的木屑[17]。條帶 E為克雷伯氏菌屬的一種，Golias和Dumsday發現產酸克雷伯氏菌P2能夠將纖維素轉變為乙醇[18]。以上這3種細菌可能具有降解纖維素的能力，但是，因為沒有能夠分離出降解纖維素的單個細菌，不能確定菌群中每個細菌的作用，我們推測菌群中各個細菌協同參與了纖維素的降解作用。

菌群在煙葉為碳源的培養基中纖維素酶活性最高可達111.07 U，孫寶魁等[14]分離得到的菌群在以秸稈為碳源的情況下，纖維素酶活性最高可達73.3 U，說明本實驗所得菌群活性較高。

對于酶活性而言，本實驗中所得菌群的最適pH為8，最適溫度為60 ℃。孫寶魁等[14]所得纖維素降解菌群在pH為6時酶活性最高，酶活性最適溫度為45 ℃。Haruta等[11]所得纖維素降解菌群在50 ℃時纖維素降解能力最強。因此，本實驗中所得菌群的最適溫度和最適pH都偏高一些。

本試驗結果顯示，溫度和pH影響菌群的纖維素酶活性，因此，陳化過程中溫度和pH都可能影響菌群對纖維素的降解，從而影響煙葉品質。菌群在進行煙葉和煙梗發酵試驗時都顯示了纖維素酶活性，這說明繼續篩選更高活性的纖維素降解菌群，是在煙葉和煙梗發酵過程中降解纖維素的一個有效途徑。

采用電熱式溫濕自控密集烤煙箱對烤煙上部煙葉進行烘烤過程中發現，由于煙葉纖維素酶的作用導致了煙葉中纖維素含量下降，并且烘烤的溫度會影響纖維素酶的活性[19]。本研究結果顯示，陳化過程中煙葉表面存在纖維素降解菌群，因此，烘烤和陳化過程都可能影響煙葉中的纖維素含量，從而影響煙葉的品質。從土壤和不同材料的堆肥中分離的纖維素分解菌能降解卷煙過濾嘴纖維[20]，對于煙葉工業生產過程以及煙草產品使用過程產生的含纖維素廢棄物的處理，也將是本文分離到的纖維素降解菌群的有效應用途徑之一。

4 結 論

首次從陳化煙葉中分離出纖維素降解菌群，說明陳化過程中微生物可能對煙葉纖維素有降解作用，從而影響煙葉的陳化效果。本研究結果也顯示，可以利用這個菌群在煙葉發酵或者煙梗發酵中降解纖維素，改善煙葉或者煙梗的品質。為了在煙草工業中應用纖維素降解菌群，有必要繼續篩選更高活性的纖維素降解菌群，以及對菌群降解纖維素的生化和分子機制進行深入研究。

[1]Zhao M Q, Wang B X，Li F X, et al.Analysis of bacterial communities on aging flue-cured tobacco leaves by 16S rDNA PCR–DGGE technology[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2007, 73∶ 1435-1440.

[2]Huang J W, Yang J K, Duan Y Q, et al.Bacterial diversities on unaged and aging flue-cured tobacco leaves estimated by 16S rRNA sequence analysis[J].Applied Microbiology and Biotechnology, 2010, 88∶553-562.

[3]趙銘欽，邱立友，張維群，等.陳化期間烤煙葉片中生物活性變化的研究[J].華中農業大學學報，2000，19（6）：537-542.

[4]趙銘欽，劉云，李芳芳，等.陳化烤煙葉面優勢菌的篩選鑒定與其增香效應[J].微生物學報，2009，49（5）：624-630.

[5]羅家基，朱子高，羅毅，等.微生物在煙葉發酵過程中的作用[J].煙草科技，1998（1）：6.

[6]徐潔，張修國，張天宇，等.微生物真菌菌劑對煙葉品質的影響[J].西南農業大學學報，2005，27（2）：163-168.

[7]余永茂，高芳馨，張敷華，等.微生物酶發酵低次煙葉初試報告[J].煙草科技，1988（5）：16-18.

[8]陳襦星，王磊，奠湘濤，等.煙葉微生物發酵的探討[J].微生物學通訊，1990（2）：37-39.

[9]謝和，秦京，王亮，等.優勢微生物在烤煙人工發酵過程中所起的作用[J].貴州農學院叢刊，1990（1）：95-107 .

[10]李國棟，馬海燕，于建軍，等.纖維素酶降解煙葉中纖維素的作用效果[J].中國農學通報，2008，24(12）：256-259.

[11]Haruta S, Cui Z, Huang Z, et al.Construction of a stable microbial community with high cellulose degradation ability[J].Applied Microbiology and Biotechnology，2002, 59∶ 529-534.

[12]Amann R, Ludwig W.Ribosomal RNA-targeted nucleic acid probes for studies in microbial ecology[J].FEMS Microbiological Reviews，2000, 24∶ 555-565.

[13]Muyzer G, Waal E C D, Uitterlinden A G.Profiling of complex microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction-amplified genes coding for 16S rRNA[J].Applied and Environmental Microbiology，1993, 59∶695-700.

[14]孫寶魁，王東偉.高效穩定纖維素分解混合菌群的篩選及分解特性研究[J].環境科學與管理，2008，33（9）：116-119.

[15]曾濤，陳漢清，曾會才.一株從金錢樹上分離的產纖維素降解酶的菌株的分離及特性鑒定[J].基因組學與應用生物學，2009，28（4）：715-719.

[16]劉佳，李婉，許修宏，等.接種纖維素降解菌對牛糞堆肥微生物群落的影響[J].環境科學，2011，32（10）：3073-3081.

[17]Ali N, Eliyas M.Hydrocarbon-utilizing microorganisms naturally associated with sawdust[J].Chemosphere，2011,83：1268-1272.

[18]Golias H, Dumsday G J.Characteristics of cellulase preparations affecting the simultaneous sacchari fi cation and fermentation of cellulose to ethanol[J].Biotechnology Letters, 2000, 22∶ 617-621.

[19]武圣江，宋朝鵬，許自成，等.烘烤過程中烤煙細胞壁生理變化研究[J].中國煙草科學，2010，31（3）：73-77.

[20]孫毓臨，譚英，劉明洋，等.卷煙過濾嘴降解菌的篩選及其降解效果的電鏡觀察[J].中國煙草科學，2010，31（3）：59-62.