HPLC 法測定柴胡不同部位4種黃酮類成分

袁王俊， 張維瑞， 吳宏欣， 薛愧玲， 李 勉*

（1.河南大學中藥研究所，河南開封475004；2.河南大學生命科學學院，河南開封 475004）

HPLC 法測定柴胡不同部位4種黃酮類成分

袁王俊1， 張維瑞1， 吳宏欣2， 薛愧玲1， 李 勉1*

（1.河南大學中藥研究所，河南開封475004；2.河南大學生命科學學院，河南開封 475004）

目的 定量測定開封市場上不同部位和不同產地柴胡中4種黃酮 （蘆丁、槲皮素、山柰素、異鼠李素）。方法以ODS2色譜柱、乙腈-0.12%磷酸水為流動相進行梯度洗脫，體積流量為1 mL/min，檢測波長為360 nm。結果

樣品間的黃酮成分的量存在明顯差異。葉片中蘆丁、槲皮素、山柰素、異鼠李素的總量遠遠高于柴胡根中。結論 柴胡莖和葉中4種黃酮總量遠遠高于傳統的入藥部位根中的量，有必要對柴胡莖、葉進行進一步的研究和開發。

柴胡；HPLC；根；莖；葉；黃酮

中藥柴胡為傘形科植物柴胡Bupleurum chinenseDC.和狹葉柴胡B.scorzonerifoliumWilld.的干燥根，前者習稱北柴胡，后者習稱南柴胡。柴胡始載于《神農本草經》，列為上品［1］。柴胡能疏散退熱，疏肝解郁，升舉陽氣，用于感冒發熱、寒熱往來、胸脅脹痛、月經不調、子宮脫垂、脫肛等癥［2］?，F代藥理研究表明，柴胡還具有抗炎、促進免疫功能，抗肝損傷和抗輻射損傷等作用［3］。柴胡在我國分布廣泛，除西藏外，各地均有分布。

柴胡為常用大宗藥材，其重要的藥用價值使需求逐年增加，不僅國內需要量大，且大量出口。由于長期依賴采挖，野生資源及其生境破壞嚴重，資源已近枯竭，目前商品柴胡主要依賴栽培。柴胡存在嚴重的種內和種間類型混雜的現象。導致柴胡品種優劣不等的問題［4］。不同地區使用的藥用部位也不盡相同。藥典規定柴胡的藥材為柴胡的根，但市場上的藥材往往是根和5～10 cm的莖的混品入藥。有人則以地上部分入藥。

柴胡中的有效成分為柴胡皂苷、甾醇、揮發油和多糖等，此外，還含有黃酮類成分，黃酮類化合物對人體在抗腫瘤、抗衰老及心血管等疾病的治療和預防有重要意義［5-6］。如蘆丁具有抗氧化、抗基因突變和降低毛細血管異常通透性及脆性的作用，臨床上用于治療過敏性紫癜及各種因毛細血管脆性增加而引起的出血性疾病，也用于治療高血壓和老年氣管炎等。槲皮素是黃酮類化合物中具有代表性的一種，研究發現槲皮素具有抗自由基、抗氧化、抗癌、抗糖尿病并發癥等多種生物活性及藥理作用，對呼吸道疾病，特別是對哮喘病和支氣管疾病有較好的作用［7-8］。

本研究采用HPLC法對來自開封市場上的柴胡樣品進行了分析，（1）考察不同產地的柴胡藥材中4種黃酮類成分的量；（2）考察同批藥材根、莖、根和莖混品4種黃酮類成分的量；（3）考察葉、莖、莖葉混合品的4種黃酮類成分的量。

1 藥材、儀器與試劑

1.1 藥材來源 柴胡藥材共7批，其中原藥材2批，分別來自鞏義五指山和洛陽嵩縣，來自陜西的1批藥材為莖葉混品，狹葉柴胡的根 （南柴胡）2批 （編號18和19），其余均為飲片，所有藥材購自開封各藥店和醫院藥房。經李勉高級實驗師鑒定為柴胡Bupleurum chinense的根 （包含5～10 cm的莖）、莖葉和狹葉柴胡B.scorzonerifolium的根。

蘆丁 （批號20736-09-8）、槲皮素 （批號117-39-5）、山柰素 （批號491-54-3）、異鼠李素 （批號480-19-3）的對照品均購自上海華藍化學科技有限公司，純度均大于98%。

1.2 儀器與藥品 Agilent 1260型高效液相色譜儀（美國 Agilent公司，包括 G1311C四元梯度泵，G1329B自動控溫自動進樣器、G1316A柱溫箱、G1314B可變波長紫外檢測器；ChemStation6.01色譜工作站）。乙腈、磷酸均為色譜純，水為樂百氏純凈水，甲醇為分析純。

2 方法與結果

2.1 樣品處理 為了分析根所帶部分莖對藥材質量的影響，將來自洛陽嵩縣和河南鞏義的藥材分為根、莖和根與莖 （1∶1）混合3種。同時將來自陜西的地上部分分為葉、莖和葉與莖 （1∶1）混合3種。將材料40℃烘干，粉碎，過60目篩。取各樣品粗粉約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入甲醇溶液25 mL，密塞，30℃水溫超聲處理1 h，濾過，回收溶劑至干。殘渣加甲醇溶解，轉移至5 mL量瓶中定容，用0.45 μL微孔濾膜濾過［9］。

2.2 定量測定

2.2.1 色譜條件 依利特Hypersil ODS2色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）。流動相為乙腈 （A）-0.12%磷酸水 （B）梯度洗脫，0～15 min（5% ～20%A）15～30 min（20% ～25%A），30～45 min（25% ～45%A），45～55 min（45% ～50%A），55～60 min（50% ～5%A）；洗脫時間為60 min；檢測波長360 nm；流量1.0 mL/min；柱溫為常溫，進樣量20 μL。

2.2.2 標準曲線及線性范圍 準確稱取蘆丁、槲皮素、山柰素、異鼠李素對照品各約5 mg，分別置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度。混勻后分別進樣 5、10、15、20、25 μL，按上述色譜條件作HPLC分析。以峰面積對進樣量進行回歸處理，得蘆丁、槲皮素、山柰素、異鼠李素的線性回歸方程和線性范圍，見表1。

2.2.3 精密度試驗 將柴胡皂苷混和對照品溶液按同樣色譜條件進行HPLC分析，連續進樣6次，每次進樣10 μL，蘆丁、槲皮素、山柰素、異鼠李素 的 RSD 分 別 為 1.37%、1.375%、1.35%、1.61%。

表1 4種黃酮標準曲線Tab.1 Calibration curves of four flavonoids

2.2.4 重復性試驗 準確稱取7號樣品粗粉約10 g，一式5份，按樣品溶液制備方法進行提取，按上述色譜條件進樣20 μL，結果樣品中蘆丁、槲皮素、山柰素、異鼠李素的 RSD分別為0.96%、0.47%、2.85%、1.64%。

2.2.5 回收率試驗 準確稱取7號樣品粗粉約2 g，精密加入蘆丁、槲皮素、山柰素、異鼠李素混標溶液0.5 mL、1.0 mL，一式3份，按樣品溶液制備方法進行提取，以同樣色譜條件分別進樣20 μL，蘆丁、槲皮素、山柰素、異鼠李素的平均回收率分別為101.6%，99.7%，103.2%，99.9%，RSD分別為1.32%、0.99%、3.01%、1.56%。

2.2.6 樣品測定 對照品、樣品圖譜見圖1、2。結果見表2。

圖1 對照品的HPLC色譜圖Fig.1 Chromatogram of reference substances

3 討論

圖2 樣品的HPLC色譜圖Fig.2 Chromatogram of sample（No.1）

3.1 不同產地柴胡飲片 （根和莖）中4種黃酮含量 柴胡是常用的中藥，以柴胡為君藥生產的中成藥多達幾十種［10］，而柴胡又分布廣泛，不同產地的藥材其質量的穩定性就顯得非常重要。從實驗數據可看出，測定的11個不同產地和批次的樣品中，蘆丁、槲皮素、山柰素、異鼠李素的總量有著明顯的差異，最低為來自河北的樣品，僅為0.166 mg/g，其次是來自南陽的樣品，為0.237 mg/g；而總量最高的為來自內蒙古的樣品，為2.085 mg/g，其次為來自禹州的一個樣品，為1.903 mg/g，這個結果與韋英杰等［9］的結果是一致的。來自同一個產地不同批次的樣品其4種黃酮的總量也存在較大的差異，來自禹州的兩批樣品的蘆丁、槲皮素、山柰素、異鼠李素的總量分別為1.903 mg/g和0.547 mg/g；來自洛陽兩個批次樣品的蘆丁、槲皮素、山柰素、異鼠李素的總量分別為0.976 mg/g和0.538 mg/g。4種黃酮成分在樣品中的分布也沒有規律，來自內蒙古的柴胡樣品中4種黃酮量高達2.085 mg/g，但僅含有山柰素一種黃酮；蘆丁在來自洛陽的兩個批次中量分別為0.578 mg/g和0.047 mg/g。因此，柴胡的黃酮總量表現出一定的地域性，也存在差異性。從表2還可以看出，收集的南柴胡樣品總黃酮量分別為0.331和0.354 mg/g。究其原因是柴胡在我國分布廣泛，目前種植柴胡種子來自野外收集，存在嚴重的種內和種間類型混雜的現象，柴胡又屬于異花授粉，因此個體間差異明顯。要想保證柴胡藥材質量的穩定性和有效性，有必要收集柴胡種質資源，開展雜交育種研究，培育優良品種，開展藥材生產管理規范（GAP）。

表2 柴胡樣品中4種黃酮測定結果Tab.2 Source of Bupleurum chinense samples and contents of four flavonoids

3.2 根、莖、根和莖混品4種黃酮類成分的量藥典規定柴胡的藥材為柴胡的根，但市場上的藥材往往是根和5～10 cm莖的混品入藥。本研究測定了兩個產地根、莖和根和莖混合品的4種黃酮的量，莖的總黃酮量最高，分別為0.973 mg/g和1.614 mg/g，根的總黃酮量最低，本別為0.13 mg/g和0.443 mg/g，其混合品的量介于二者之間，分別為0.774 mg/g和0.976 mg/g?？傊o的存在使柴胡黃酮含量提高。

3.3 葉、莖、莖葉混合品的4種黃酮類成分的量與傳統的藥用部位相比，葉片、莖和莖葉混合品的4種黃酮總量要明顯高出很多，分別為15.667 mg/g、10.034 mg/g和12.557 mg/g。傳統藥用部位最高僅為2.085 mg/g。還可以看出，葉片中4種黃酮總量最高，莖最低，混合品介于二者之間。比較與根緊密相連的莖和葉片中的莖，可以發現，葉片中的莖含量明顯要高。總之，就黃酮量分析葉片和莖的含有量要高于傳統使用的根。小葉黑柴胡傳統的入藥部位也是根，劉秀芳等［11］研究認為小葉黑柴胡莖葉總黃酮具有很好的抗氧化活性；詹雪晶等［12］研究認為柴胡莖葉總黃酮對四氯化碳 （CCl4）所致小鼠急性肝損傷的保護作用。很有必要對莖、葉進行進一步的研究，探討其替代根的可能性，擴大柴胡用藥部位，保護野生資源。

［1］茅仁剛，林東昊，王智華，等.HPLC法測定不同品種柴胡中的柴胡皂苷a、c、d的含量［J］.中草藥，2002，23（5）：412-414.

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Determination of four flavonoids in different parts of Bupleurum chinense by HPLC

YUAN Wang-jun1， ZHANG Wei-rui1， WU Hong-xin2， XUE Kui-ling1， LI Mian1*
（1.Institute of Chinese Materia Medica，Henan University，Kaifeng 475004，China；2.College of Life Sciences，Henan University，Kaifeng 475004，China）

Bupleurum chinenseDC.；HPLC；root；stem；leaf；flavonoid

R284.1

A

1001-1528（2013）04-0797-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2013.04.038

2012-05-10

國家自然科學基金 （30971076）

袁王俊 （1972—），男，講師，研究方向：中藥資源。E-mail：yuanwangjun@henu.edu.cn

*通信作者：李 勉 （1954—），女，高級實驗師，研究方向：中藥鑒定。E-mail：limian0378@163.com