水庫水中葉綠素a測定方法比較

冷維亮 畢欽祥 劉英昊 史 振 朱琳琳

（山東省濰坊市水文局 濰坊 261031）

1 引言

在水庫富營養化的研究中，葉綠素a是表征浮游植物生物量的最常用指標之一。葉綠素a的實驗室測量方法有分光光度法、熒光法、色譜法，其中傳統的分光光度法因所需儀器價格較低、操作簡單、測定結果穩定，因此應用最為廣泛。2013年之前采用的標準方法存在耗時長、提取不完全、步驟繁瑣等缺點，根據一些文獻報道提出的對標準方法的優化和改進，水利部發布了新的測定標準以代替原先采用的測定標準。新標準與老標準的不同之處主要包括以下四個方面：（1）改變了濾膜類型，用玻璃纖維濾膜代替了原標準中的醋酸纖維濾膜；（2）改變了水樣過濾時的操作，由原標準的抽干濾膜改為不抽干濾膜，而是在減壓狀態下緩慢結束抽濾，最后用濾紙吸干水分；（3）改變了細胞破碎方式，用反復凍融法代替了之前的研磨法；（4）改變了提取時間，由原標準的24h改為4～12h。新標準已經發布近一年時間，目前尚無對新老標準的系統性比較評價。

本文選取以上新老標準中的4點不同，以濰坊峽山水庫的庫中水樣為實驗對象，進行葉綠素a的測定比較。從葉綠素a細胞破碎的程度、提取的完全性、數據的穩定性和操作的簡便性等方面對兩種測定方法進行比較，為水庫的富營養化浮游植物的生物量的快速、穩定且準確的表征標準的選擇提供資料。

2 實驗材料與方法

2.1 材料

峽山水庫庫中水20L，采集于深色塑料桶中，每升水樣加入1mL1%的碳酸鎂懸濁液，以防止酸化引起的色素溶解。

化學試劑：90%丙酮溶液、1%碳酸鎂懸濁液。

其他材料：醋酸纖維濾膜（0.45μm）、玻璃纖維濾膜（0.7μm）、研缽、布氏漏斗、抽濾瓶、具塞刻度離心管(10mL)、移液管等。

2.2 主要儀器與設備

真空泵、離心機、超低溫冰箱、UV-分光光度計等。

2.3 實驗方法

實驗由兩名分析人員同時進行。根據需要比較的內容，分別根據新老標準進行以下4個步驟。由于比較的側重點放在新標準上，所以除比較的步驟外，其他均按照新標準進行操作，A組嚴格按照新標準進行操作，作為參照組與其他組進行比較。根據峽山水庫庫中水葉綠素a常規含量，均取1000mL水樣進行測定，比色皿光程選用3cm。

2.3.1葉綠素a的抽濾

2.3.1.1濾膜的選擇

A組選取玻璃纖維濾膜（0.7μm），B組選取醋酸纖維濾膜（0.45μm）進行抽濾。均在水樣剛剛完全通過濾膜時結束抽濾，用鑷子小心將濾膜取出，將有樣品的一面對折，用濾紙吸干剩余水分。

2.3.1.2抽濾的操作

均選取玻璃纖維濾膜（0.7μm）進行抽濾，A組逐漸減壓，在水樣剛剛完全通過濾膜時結束抽濾。用鑷子小心將濾膜取出，將有樣品的一面對折，用濾紙吸干剩余水分。C組抽濾至過濾器內無水分后，繼續抽濾幾分鐘。

2.3.2葉綠素a的提取

2.3.2.1細胞的破碎

均選取玻璃纖維濾膜（0.7μm）進行抽濾，且按照以上2.3.1.2中A組的方法處理濾膜。A組將過濾后的濾膜放入具塞玻璃離心管中，蓋緊塞帽，放入-40℃低溫冰箱中冷凍20min，取出放置于室溫下5min，此過程反復3次。向離心管中加入10mL90%丙酮溶液，蓋緊塞帽劇烈搖振片刻。D組將載有濃縮樣品的濾膜放入研缽中，加入3mL丙酮溶液至濾紙浸濕的程度，把濾膜研碎，再少量地加90%的丙酮溶液，把濾膜完全研碎，然后用90%丙酮溶液將已磨碎的濾膜和丙酮溶液洗入帶刻度的帶塞離心管中。

2.3.2.2葉綠素a的提取

均使用反復凍融法對細胞進行破碎，A組放置于4℃冰箱中避光浸泡12h備用，在浸泡過程中再次搖振2～3次。E組置于4℃的冰箱中避光浸泡24h。

3 實驗結果與比較

3.1 實驗結果

對以上5組提取液測定吸光度，求算葉綠素a含量。檢測結果見表1，其中1、2為兩位分析人員的編號。

實驗結果表明，從對葉綠素a提取的效率即葉綠素a提取含量的均值看，濾膜類型的選擇和提取時間12h/24h對檢測結果基本沒有影響，抽濾方式和細胞破碎方式的不同對檢測結果的影響較為明顯。以下將結合實驗過程進行詳細分析。

3.2 濾膜選擇的影響

雖然對最終檢測的結果影響較小，但在實驗過程中發現，選取醋酸纖維濾膜（0.45μm）的B組在測定吸光度時，750nm處的吸光度在0.007～0.010之間，不能滿足標準不超過0.005的要求。經過取上清液再次離心、標定，此過程反復2次，經第3次離心之后吸光度才滿足標準要求。造成這種情況的原因在于醋酸纖維濾膜能夠部分溶解于丙酮溶液中，對750nm處的吸光度造成一定的影響，而玻璃纖維濾膜是不溶于丙酮溶液的。所以，在條件允許的情況下，盡量選取玻璃纖維濾膜，否則應多次離心或者離心后采用針式過濾器過濾，保證750nm吸光度不超過0.005。

表1 檢測結果比較

3.3 抽濾選擇的影響

從實驗結果看，抽干的濾膜檢測結果要比用濾紙吸干偏小。造成這種情況的原因在于采用反復凍融法對細胞進行破碎，是利用細胞內冰粒的形成和細胞液濃度的增高引起溶脹來達到破碎細胞壁的目的，因此抽濾后的濾膜不宜過干。所以在凍融的過程中，由于濾膜水分含量較少，冰凍和溶解時間不宜過長，冰凍時間應控制在20～30min，溶解時間為5min左右，濾膜變軟即可。

3.4 細胞破碎方式的影響

大量文獻表明，研磨法容易造成檢測結果偏低，這與本次實驗的結果是吻合的。研磨過程中，細胞的破碎程度、洗脫的程度以及研磨時間的長短都會因操作人員的不同而有所變化，造成對提取效率、損失程度和光解程度的影響。并且由于研磨的程度不同，為避免濾膜殘片對測定吸光度的影響，需要經過多次離心，本次實驗為2次離心。而凍融法只要冰凍和溶解的溫度和時間一致，細胞的破碎程度不會受到人員不同的影響。并且，凍融法減少了分析人員接觸丙酮的時間，保護了分析人員的身體健康；且操作簡單，轉移次數少，降低了樣品的損失，避免了研磨中的人為誤差，提高了檢測的準確度和精確度。

3.5 提取時間的影響

從實驗結果看，提取時間12h和24h對檢測結果基本沒有影響。但從檢測的效率來看，12h剛好可以利用夜間時間，符合實際檢測工作的需要。

4 結論

以濰坊峽山水庫的庫中水為實驗對象，經試驗比較：

（1）從實驗耗時和操作復雜程度來看，應選用玻璃纖維濾膜。

（2）根據反復凍融法的需要，抽濾后的濾膜不宜過干，所以應在水樣剛剛完全通過濾膜時結束抽濾。用鑷子小心將濾膜取出，將有樣品的一面對折，用濾紙吸干剩余水分。

（3）無論是從方法的可靠性和穩定性，還是從實驗耗時和操作復雜程度來看，反復凍融法都要優于研磨法。

（4）提取時間12h/24h對檢測結果基本沒有影響。根據實際檢測工作的需要，提取時間12h較為合理。

綜合上述分析，相比之前的標準方法，新標準提取效率高、穩定性好、耗時短、操作簡單，是一種合理實用的葉綠素a測量方法，尤其是應急監測或大批量水環境樣品測定時更顯優勢■