關節軟骨細胞體外培養及生物學特性的實驗研究

趙 明，陳 竹，張旭乾，劉 康，馮 剛，劉麗華，韓小偉

(1.川北醫學院第二臨床醫學院組織工程與干細胞研究所;2.南充市中心醫院病理科，四川 南充 637000)

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關節軟骨退行性變疾病，是一類具有高發病率和高致殘率的退行性關節疾病，以骨關節炎(osteoarthritis，OA)最為常見［1］。目前尚缺乏有效的治療方法。其主要生化改變為軟骨細胞凋亡，因此探索增殖過程中的軟骨細胞變化規律是研究關節軟骨破壞及變性的病理及治療的重要方面［2］。本次實驗在司徒鎮強［3］曾采用的軟骨細胞體外培養方法基礎上改進及創新，使培養方法簡單易行，并觀察體外培養的軟骨細胞生物學特性變化，為關節軟骨缺損及退行性變防治及運動醫學的發展奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 4 周齡新西蘭乳兔(川北醫學院動物中心提供)。

1.1.2 主要試劑 Ⅱ型膠原酶，胰蛋白酶(1∶250)，PBS 緩沖液(凱基生物)，胎牛血清(HYCLONE)，DMEM 培養液/高糖(HYCLONE)，青鏈霉素混合液(南京凱基生物)，RNA 提取試劑盒(Bioteke Corporation)，PCR 試劑盒(Fermentas)，Type Ⅱcollagen staining Kit(chondrex)。

1.2 實驗方法

1.2.1 兔關節軟骨細胞原代培養 取4 周齡新西蘭乳兔1 只(購買于川北醫學院動物實驗中心)，耳緣靜脈空氣栓塞致死，酒精消毒，剔除雙膝和雙肘關節的皮膚及肌肉，浸泡于含雙抗的PBS 中。在超凈臺上分離關節軟骨面，仔細清除軟骨表面滑膜，刀片削下軟骨，將其剪碎成1 mm3大小碎片，PBS 沖洗3 次后，置入50 mL 離心管中，然后加入等體積胰酶，置于37 ℃恒溫水浴消化，每5 min 振蕩1 次，45 min 后取出，1 500 r/min 離心5 min，棄上清，加入等體積0.1%Ⅱ型膠原酶后，置于37 ℃恒溫水浴消化8 h。取20%FBS 加入離心管稀釋，離心，棄上清，再次加入20%FBS 入離心管稀釋，離心，棄上清，沉淀移入細胞瓶中，加20% FBS 10 mL 于瓶內，靜置于5% CO2，37 ℃培養箱培養，每3 天更換1 次培養液。

1.2.2 兔關節軟骨細胞傳代培養 運用倒置顯微鏡觀察軟骨細胞匯合成片(約80% ～90%)，可進行傳代培養。倒去培養液，PBS 清洗1 次，加入0.25%胰蛋白酶2 mL，消化至細胞出現圓形，個別細胞開始浮游時加入10% FBS 2 mL 中和胰酶，吹打細胞使其散開形成軟骨細胞懸液，計數后分瓶培養。

1.2.3 生長曲線測定 取生長良好的第1 代細胞，用0.25%胰酶消化制成懸液，以每孔濃度2 ×104/mL 接種，每孔接種1 mL，接種后在8 d 內每天取3 孔進行細胞計數，每孔3 次，取平均值，繪制其生長曲線。

1.2.4 關節軟骨collagen Ⅱ，aggrecan DNA 水平檢測 總RNA 按照RNA 提取試劑盒說明書進行提取，逆轉錄反應以oligo(dT)作為引物合成cDNA，RT-PCR 檢測利用Fermentas 公司兩步法PCR 試劑盒進行。

1.2.5 甲苯胺藍及番紅-O 染色觀察 ①甲苯胺藍染色:細胞在蓋玻片上長滿成片(70% ～80%)后取出，PBS 沖洗，4 %中性甲醛固定10 min，用1%甲苯胺藍染色4 h，迅速用無水乙醇漂洗1 次，靜置于空氣中干燥，顯微鏡下觀察。②番紅-O 染色:細胞在蓋玻片上長滿成片(70% ～80%)后取出用PBS 沖洗，4 %中性甲醛固定10 min，蘇木素染色3 min，水洗3 次，快綠染色5 min，鹽酸酒精分化3 s，水洗3 次，番紅-O染色3 min，梯度酒精脫水，干燥后顯微鏡下觀察。

1.2.6 關節軟骨合成aggrecan 及collagen Ⅱ能力的檢測 aggrecan 免疫熒光染色:細胞在蓋玻片上長滿成片(70% ～80%)后取出用PBS 沖洗，冷丙酮固定10 min，水洗3 次，正常血清(與二抗同源)封閉15 min，添加一抗4 ℃過夜，PBS 水洗3 次，添加生物素化二抗，PBS 水洗3 次，抗熒光淬滅劑封片。Ⅱ型膠原免疫組化染色按照TypeⅡcollagen staining Kit 進行。

2 結果

2.1 細胞培養及形態觀察

軟骨組織原代培養7 d 后，約少許細胞從軟骨邊緣游離爬行而出，貼壁生長。貼壁后的細胞圓形增大逐漸展開、變平、伸出短小的突出，外觀呈多角形，如圖1A 所示。14 d 后細胞胞核清楚，為圓形或橢圓形，胞質豐富，細胞外基質具有折光性，部分細胞重疊生長成細胞簇(集落)，單層生長的細胞呈典型鋪路石樣表現，如圖1B 所示。

2.2 傳代培養

當原代細胞(P0)數量長至80% ～90%左右進行傳代，傳代細胞24 h 后即可貼壁，細胞充分鋪展，且生長分裂能力強于P0，一般5 ～7 d 可長滿呈單層分布，細胞形態仍以圓形，多角形為主。P1 及P2 細胞增殖能力強于其它代，但隨著傳代次數的增加，細胞呈現梭型改變明顯，其增殖分裂能力下降，如圖2 所示。后呈現的顏色變化觀察，隨著傳代數目增多，軟骨細胞染色越淡，表明軟骨細胞隨著傳代次數的增加產生了一定的變異，其分泌細胞外基質的能力下降(圖7)。

3 討論

軟骨組織由軟骨細胞、細胞外基質及纖維組織構成。軟骨組織可通過酶解的方式從中游離出軟骨細胞，但所需相關酶甚多(如:睪丸透明質酸酶、胰蛋白酶、膠原酶等)，且常破壞軟骨細胞的活性，同時反復離心獲取細胞的操作也較復雜，增加了污染的幾率。本實驗嘗試關節軟骨組織經胰蛋白酶及Ⅱ型膠原酶消化后離心取沉淀組織塊靜置培養，3 d后約少許原代細胞緣軟骨組織邊緣爬出，7 d 可達60%左右，與以前研究者［3－4］采用方法相比，此方法操作簡單，污染機率小，獲得原代軟骨細胞數量多。但其距離應用實驗所需細胞數量尚不足，通過此方法游離出的原代軟骨細胞傳兩代后獲得的第二代軟骨細胞數量可滿足實驗需求，PCR 技術鑒定二代軟骨細胞特有標志基因表達正常，蛋白多糖及堿性糖氨聚糖的高表達表明其分泌活性高。因此通過軟骨組織貼壁方式獲得原代軟骨細胞是一種簡便易行的培養方法，且經此方法獲得的傳二代軟骨細胞具有高活性。

本實驗成功建立的關節軟骨細胞培養方法為組織工程化軟骨奠定了技術基礎。此方法可在短時間內高效獲取大量軟骨細胞，但我們隨后對持續傳代的軟骨細胞進行相關研究后發現隨著傳代次數的增加，細胞形態及分泌基質將發生改變。細胞形態由鋪路石或類三角型狀轉變為成纖維狀，細胞出現指狀突起，軟骨細胞分泌的collagen II 越來越少。推測此現象的出現其一可能與細胞脫離了自身生理環境有關，失去了生理環境對軟骨細胞生長及分化的影響。其二與傳代本身有一定聯系，據Tamamura等［5］通過real-time PCR 測定傳代后的軟骨細胞的Ⅱ型膠原和蛋白多糖變化發現傳代對細胞表型影響較大。其三與傳代時接種密度有關，剛傳代后的細胞一部分消化死亡，一部分緩慢貼壁，此時細胞數量過低，細胞接觸作用差，細胞自分泌功能較弱。本實驗通過研究認為選用3 代以內軟骨細胞進行實驗研究較可。但仍有學者研究各種保持細胞表型的方法，使體外實驗所需細胞狀態更接近體內細胞，如李文輝等［6］研究持續靜壓力和力學刺激對調控軟骨代謝和維持其胞外基質正常表型的影響，此外還有運用生物反應器及添加生長因子［7］進行培養。雖然以上方法對體外培養的軟骨細胞表型維持都具有一定效果，但常需耗費大量時間與經費。本實驗方法經濟、簡單且實用，在較短時間內可獲得大量純化的兔軟骨細胞，能為關節軟骨缺損、退行性變治療及組織工程化軟骨研究提供充足的細胞來源。

［1］ Felson DT，Lawrence RC，Dieppe PA，et al.Osteoarthritis:new insights.Part 1:the disease and its risk factors［J］.Ann Intern Med，2000，133(8):635 －646

［2］ Masahiko K，Ginette RS，Aisha M，et al.Role of interleukin and tumor necrosis factorαin mat rix degradation of human osteoarthritic cartilage［J］.Art hritis ＆ Rheum，2005，52 (1):128 －135

［3］ 司徒鎮強，吳軍正.細胞培養［M］.西安:世界圖書出版公司，1996.109

［4］ 俞永林，任志偉，喬 健，等.兔關節軟骨細胞的分離培養及生物學特征［J］.復旦學報(醫學版)，2006，33 (6):753

［5］ Tamamura Y，Iwamoto M.Rapid phenotypic changes in passaged articular chondrocyte subpopulations［J］.J Orthop Res，2005，23(2):425 －432

［6］ 李文輝，侯筱魁.軟骨組織工程種子細胞及其培養方法［J］.中華創傷骨科雜志，2003，5(3):244 －246

［7］ 陳北北.體外培養軟骨細胞與生長因子的加入［J］.中國組織工程研究與臨床康復雜志，2010，46(16):8568 －8571