體外共培養誘導脂肪干細胞向軟骨表型細胞分化及鑒定的實驗研究

蔣 婷，楊澤龍，劉 康，陳 竹，白亦光，李凌云，白 倩，馮 剛

(1.川北醫學院第二臨床學院·南充市中心醫院燒傷整形美容外科，四川 南充 637000;2.川北醫學院第二臨床學院·南充市中心醫院骨科，四川 南充 637000;3.川北醫學院第二臨床學院組織工程與干細胞研究所，四川 南充 637000)

隨著我國人口老齡化的到來，關節軟骨退變與缺損病人逐年呈上升趨勢，是臨床醫生面臨的又一重大挑戰。一般情況下，關節軟骨創傷或退變缺損一旦超過4 mm就很難自身修復，采用自身軟骨移植來修復軟骨缺損成為臨床治療的一種新方法，具有遠大的前景。但是，自身軟骨來源比較困難且增殖能力有限，很難滿足實際的應用。隨著組織工程研究的不斷進展，脂肪干細胞(adipose derived stem cells，ADSC)的應用潛能越來越受到研究者的關注并成為熱點［1-3］。有大量研究表面，ADSC經過不同誘導因子的作用，可以向脂肪細胞、軟骨細胞、肌肉細胞和成骨細胞等分化。特別是其向軟骨細胞方向分化的潛能越來越受到人們的重視。然而繼往的誘導方法主要是應用多種不同的誘導因子來進行，操作過程復雜，難以實際應用于臨床。本研究通過將軟骨細胞與ADSC共培養，利用軟骨細胞分泌相關因子提供的微環境，將ADSC成功定向誘導為軟骨表型細胞，有望為臨床軟骨缺損的修復和軟骨組織工程提供一種新的種子細胞來源的方法。

1 材料與方法

1.1 主要材料

清潔級2周齡日本大耳白兔，雌雄不限，體重0.4～0.6 kg，由川北醫學院實驗動物中心提供。DMEM培養液及胎牛血清(Gibco公司)，胰蛋白酶、Ⅰ型膠原酶、復合膠原酶(NB4)、反轉錄酶(Sigma公司)，transwell小室(孔徑 0.4 μm，Caster，美國)，番紅及甲苯胺藍染液(南京夏斯生物)等。

1.2 方法

2周齡日本大耳白兔空氣栓塞處死后，按無菌操作取下肋軟骨與腹股溝皮下脂肪。

1.2.1 軟骨細胞的分離與培養 將肋軟骨剪碎至0.3～0.5 mm大小，2.5%胰酶37℃消化30 min，2000 r/min×5 min離心取沉淀，PBS洗3次，再用1%的復合膠原酶(NB4)37℃消化約8 h，200目濾網去除未消化軟骨塊。濾液離心，PBS液洗3次后得到軟骨細胞，將軟骨細胞接種于培養瓶，加入含10%FBS的DMEM培養基培養，每3天換液，細胞生長至瓶底的80%到90%傳代，取P1代細胞備用。

1.2.2 ADSC的分離與培養 將兔腹股溝脂肪盡量剪碎，加入0.75 g/LⅠ型膠原酶37℃消化1 h，中和Ⅰ型膠原酶，200目濾網去除未消化脂肪團塊，用含10%FBS的DMEM培養液懸浮1 500 r/min×5 min離心，將沉淀中加入紅細胞裂解液10 min后再次以1 500 r/min×5 min離心去上清后獲得ADSC，用含10%FBS的DMEM培養液懸浮接種，每3天換液，細胞生長至瓶底的80%到90%傳代，取P1代細胞備用。

1.2.3 軟骨細胞與ADSC共培養 將P1代軟骨細胞和ADSC制作成細胞懸液，軟骨細胞按1.0×105/L接種于6孔培養板共12孔，24 h觀察軟骨細胞貼壁后吸去培養液，在其中的6孔中放入transwell小室，膜底與貼壁細胞相接觸，然后在transwell小室中按ADSC比軟骨細胞細胞為3∶1的比例接種軟骨細胞;其它6孔放入transwell小室，不接種軟骨細胞作為對照。每孔均加入含10%FBS的DMEM培養液3 mL培養，每3天采用半量換液，共培養2周。

1.2.4 誘導后ADSC的檢測 safranin-O和甲苯胺藍染色觀察誘導后ADSC蛋白多糖的分泌情況，Ⅱ型膠原免疫化學染色觀察誘導后ADSCⅡ型膠原分泌情況;rt-PCR檢測Ⅱ型膠原基因表達情況，按試劑盒的說明操作。

2 結果

2.1 細胞的形態學觀察

軟骨細胞接種培養24后貼壁，細胞伸展后呈多角形，6 d左右可達90% 以上融合;ADSC原代呈集落生長而傳代后呈梭形，排列規則(圖1)。

2.2 safranin-O染色

safranin-O染色顯示與軟骨細胞共培養2周后，ADSC的胞漿出現紅染。單獨的ADCS培養對照組僅顯示微弱的淡紅，而大部分細胞顯示為亮綠染料的淡綠色(圖2)。

2.3 甲苯胺藍染色

甲苯胺藍染色顯示與軟骨細胞共培養2周后，ADSC的胞漿出現藍色。而對照組僅顯示微弱的淡藍色，這說明共培養后的ADSC有蛋白多糖表達(圖3)。

2.4 Ⅱ型膠原的免疫細胞化學染色

免疫細胞化學顯示與軟骨細胞共培養2周后，ADSC的胞漿中出現較多的粗大棕色顆粒，未共培養組細胞沒有顯色，僅有非特異的異染。說明共培養后ADSC表達了Ⅱ型膠原(圖4)。

2.5 rt-PCR檢測Ⅱ型膠原基因表達

與軟骨細胞共培養2周后，ADSC具有與軟骨細胞接近的Ⅱ型膠原基因轉錄水平，而對照組則為陰性(圖5)。

3 討論

關節軟骨退行性變或外傷引起的軟骨缺損是一種常見病、多發病，是導致中老年人關節疼痛、運動功能障礙的最主要原因之一。在年齡超過50歲的人群中，關節軟骨退行性變致殘的發病率僅次于心血管疾病。正常的關節軟骨由于沒有神經及血管組織，其營養主要依靠彌散機制，從滑膜分泌的滑液中攝取，且關節軟骨細胞代謝緩慢，一旦發生缺損，其愈合能力非常有限，關節軟骨損傷后的修復主要是細胞的反應性增殖，但多數人認為這種機制并不能使受傷軟骨完全修復，一旦損傷發生即成為永久性病變［4-5］。有許多研究者進行關節軟骨或軟骨細胞移植來治療關節軟骨退變缺損，取得了一定的臨床效果，但是軟骨的來源不足使細胞移植或軟骨移植應用于臨床的受到很大的限制。組織工程化軟骨是軟骨移植修復缺損的另一個研究熱點，但種子細胞的來源不足仍然是目前組織工程軟骨發展的關鍵瓶頸［6-9］。

ADSC是近年來從脂肪組織中分離得到的一種具有多向分化潛能的干細胞。研究發現ADSC細胞能夠在體外穩定增殖且衰亡率低，同時它具有取材容易、少量組織即可獲取大量干細胞，適宜大規模培養，對機體損傷小等優點，而且其來源廣泛，體內儲備量大，適宜自體移植，逐漸成為近年來新的研究熱點。Zuk等［10］從人體抽吸的脂肪組織中分離培養出成纖維樣細胞，此細胞能在體外穩定擴增，使用免疫熒光和流式細胞儀分析發現，這些細胞大部分來源于中胚層或間充質，在一定條件下可以向脂肪細胞、軟骨細胞、肌肉細胞和成骨細胞分化。Gronthos等［11］對脂肪抽吸物培養細胞的表面標記研究表明，這些細胞具有與骨髓間充質干細胞相似的表面抗原表達，這說明脂肪來源細胞中的確存在間充質干細胞特性的細胞，稱為脂肪組織來源干細胞，脂肪干細胞的概念由此正式提出。此后人們對脂肪干細胞作了大量的研究［12-14］，取得了許多重要的進展。這為脂肪干細胞應用于軟骨組織工程構建和臨床治療帶來了希望。

在以往的許多研究中，脂肪干細胞誘導成軟骨表型細胞需要許多誘導因子諸如 TGF-β1、GDF-5、IGF-I、BMP-2等，操作過程復雜、條件要求苛刻、花費較高，難以應用于臨床。本研究采用軟骨細胞與ADSC共培養的方式，通過軟骨細胞提供的微環境，成功地將ADSC誘導成軟骨表型細胞。經過safranin-O染色、甲苯胺藍染色及Ⅱ型膠原免疫化學染色和rt-PCR檢測證實了經過誘導后的ADSC能表達軟骨細胞特有的細胞外基質。該方法操作簡單、成本低廉、技術要求不高，有利于促進ADSC在軟骨組織工程或臨床方面的應用。但是其誘導的穩定性和能否良好地修復軟骨缺損仍需要進一步研究證實。

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