人脂肪間充質干細胞的原代培養及體外成骨成脂誘導分化

閔敏，張雪靜，馬紅，許輝，李遇梅

(1.江蘇大學附屬醫院皮膚科，江蘇 鎮江 212001;2.鎮江市第二人民醫院皮膚科，江蘇 鎮江 212002)

對于間充質干細胞的研究，最初的對象是骨髓間充質干細胞，并且已經形成了成熟的分離培養方法［1］。但是，近年來，人們逐漸將干細胞的研究重點轉向脂肪間充質干細胞(adipose-derived mesenchymal stem cells，ADSCs)，因其在組織來源，分離方法等方面顯示出優越性［2］，現已被廣泛應用于科研和臨床研究中。人脂肪間充質干細胞是由Zuk等［3］首次從人抽脂手術中分離獲得，具有很強的增殖和多向分化能力。在臨床研究中，脂肪間充質干細胞在細胞移植及組織工程等方面也有著廣泛的應用前景［4］。本實驗試圖探索高效獲得專一性未分化的人脂肪間充質干細胞的方法，并對其生物學特性及分化特性作進一步觀察。

1 材料和方法

1.1 臨床標本

人脂肪組織來源于10例產科剖宮產手術者的腹部皮下脂肪，年齡23～35歲，平均為30歲，體質量指數22～24 kg/m2。所有產婦健康狀況良好，無系統性疾病，術前均簽訂知情同意書，并經醫院倫理委員會通過。

1.2 試劑與儀器

Ⅰ型膠原酶購自美國 Sigma公司。低糖DMEM、高糖 DMEM、胎牛血清購自美國 Gibco公司。噻唑藍(MTT)購自美國Amersco公司。碘化丙啶(PI)購自美國 BD公司。鼠抗人 CD31-FITC、CD34-PE、CD45-PE、CD29-FITC、CD44-FITC、CD73-FITC購自美國Biosciences公司，鼠抗人CD105-PE、CD166-PE購自美國Biolegend公司。地塞米松、抗壞血酸、β-甘油磷酸鈉、吲哚美辛、異丁基甲基黃嘌呤(IBMX)以及胰島素均購自美國Sigma公司。Trizol購自美國 Invitrogen公司。反轉錄試劑盒及SYBR-PCR試劑盒購自TaKaRa公司。酶聯免疫檢測儀為澳大利亞Clinibio公司產品。流式細胞儀為美國BD公司產品。免疫熒光顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 hADSCs的分離和培養 實驗步驟在Zuk等［3］的基礎上作了部分調整。無菌條件下獲得脂肪組織約15 mL，分離去除脂肪組織表面的結締組織包膜及血管，剪碎至約1 mm3細小顆粒。加入0.15%Ⅰ型膠原酶于37°C恒溫搖床150 r/min消化45 min，期間每隔10 min取出混勻。加入等體積含10%血清低糖DMEM中和Ⅰ型膠原酶活性。200目篩網過濾，去除消化后產生的碎片組織，1 500 r/min離心10 min，去除上層未消化的脂肪組織及油脂，沉淀重懸，PBS洗2遍。用含10%胎牛血清，100 U/mL青霉素，100 μg/mL鏈霉素的低糖DMEM重懸，以(1～5)×104/cm2接種至六孔板中。放入37°，5%CO2培養箱中培養，48 h后首次換液，之后每3天換液。細胞達80%融合后用0.25%胰酶-0.02%EDTA消化，1∶3傳代接種。

1.3.2 細胞生長動力學分析 以第3代、第7代和第10代細胞為標本，制備單細胞懸液，調整密度為4×104個/mL，接種于96孔板。從第2天起，每天固定時間取3孔加入MTT溶液(5 mg/mL)20 μL，置37℃培養箱孵育4 h后吸棄上清液，每孔加入150 μL二甲基亞砜。搖床震蕩10 min，用酶聯免疫檢測儀以490 nm波長檢測各孔光密度(D)值。計算均值，以時間為橫坐標，光密度值為縱坐標繪制生長曲線。

1.3.3 細胞免疫表型檢測 第5代hADSCs胰蛋白酶消化后制成單細胞懸液。將細胞分裝于1.5 mL的EP管中，每管100 μL，細胞密度為105/mL，加入熒光標記抗人 CD31-FITC、CD34-PE、CD45-PE、CD29-FITC、CD44-FITC、CD73-FITC、CD105-PE、CD166-PE，以IgG2a–FITC、IgG1-PE為陰性對照。4℃避光孵育30 min，流式細胞儀檢測細胞表面抗原。

1.3.4 細胞免疫熒光 用多聚賴氨酸包被玻片，將玻片置于六孔板內，接種細胞。待細胞貼壁后，4%低聚甲醛室溫固定30 min，5%牛血清蛋白(BSA)室溫封閉 10 min，0.3%TritonX-100 處理 10 min，提高細胞膜的通透性。滴加鼠抗人CD31-FITC、CD34-PE、CD45-PE、CD29-FITC、CD44-FITC、CD73-FITC、CD105-PE、CD166-PE、HLA DR-FITC 共同室溫避光孵育30 min，PBS洗滌2遍，DAPI室溫染色10 min，PBS洗滌2遍，熒光顯微鏡觀察，拍照。

1.3.5 成脂分化 取第3代hADSCs接種于24孔板，待細胞融合達80%后，改用成脂肪誘導培養基(含高糖 DMEM，10%FBS，1 μmol/L 地塞米松，50 μmol/L 吲哚美辛，0.5 mmol/L IBMX，10 μmol/L 胰島素)誘導2周，每2天換液1次，對照組加普通培養液。鏡下觀察細胞形態變化，2周后油紅染色鑒定脂滴［5］。

1.3.6 成骨分化 取第3代hADSCs接種于24孔板，待細胞融合達80%后，改用成骨誘導培養基(含高糖 DMEM，10%FBS，1 μmol/L 地塞米松，200 μmol/L 抗壞血酸，10 μmol/L β-甘油磷酸鈉［6］)誘導4周，每3天換液1次，對照組加普通培養液。鏡下觀察細胞形態變化，4周后行茜素紅S染色鑒定鈣結節［7－8］。

1.3.7 RT-PCR檢測過氧化物酶體增殖物激活受體γ-2(PPARγ-2)、骨橋蛋白 mRNA的表達 使用Trizol法提取未分化和成脂成骨分化后hADSCs的RNA。將完全RNA作為模板，進行反轉錄反應。其后按照RT-PCR試劑盒說明書對人骨橋蛋白，PPARγ-2進行擴增。人骨橋蛋白引物序列:上游5'-ACAGGCTGATTCTGGAAGTTCTG-3'，下游5'-GGCT TTCGTTGGACTTACTTGG-3';人PPARγ-2引物序列:上游 5'-TGGAATTAGATGACAGCGACTTGG-3'，下游5'-CTGGAGCAGCTTGGCAAACA-3'。人 β-肌 動 蛋白:上游5'-TGGCACCCAGCACAATGAA-3'，下游5'-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3'。

1.4 統計學分析

(2)分散土筑堤破壞主要是由降雨沖刷、徑流淘刷等方式侵蝕堤防土料，利用堤體內部缺陷，形成裂縫，表現為流土沖蝕、管涌、崩岸等破壞型式，進而造成潰壩危害。

2 結果

2.1 hADSCs生長情況

分離培養 hADSC接種于六孔板，48 h后貼壁，換液去除非貼壁細胞;3 d后倒置顯微鏡下可見細胞形態改變較均一，成纖維細胞樣生長。細胞生長有極性，融合后成螺旋狀，第1次7～10天可以傳代。1∶3傳代，5～7天可融合。培養12代以內細胞的形態無明顯變化(圖1)。

圖1 第3代人脂肪間充質干細胞形態(倒置顯微鏡×100)Fig 1 Cellular morphology of the third generation hADSCs

2.2 細胞生長曲線

生長曲線顯示不同代數hADSCs之間的增殖情況無明顯差異，在6～7 d時可以達到一個生長高峰(圖2)，表明體外培養的hADSCs具有強大的增殖能力。

圖2 人脂肪間充質干細胞生長曲線Fig 2 Human adipose derived stem cells growth curve

2.3 細胞免疫表型

由于至今尚未發現間充質干細胞特異性的表面標志，通過鑒定多個表面標志物來鑒定hADSCs，包括黏附分子 CD29，CD166，間質標志物 CD73，CD105［9］。結果顯示 hADSCs 高表達 CD29、CD73、CD105、CD166，陽性率分別為(95.78 ±2.31)%，(96.70 ± 2.81)%，(99.23 ± 0.29)%，(99.01 ±0.11)%，低表達 CD31、CD34、CD45、HLA-DR，陰性率 分 別 為 (0.29 ±0.15)%，(1.67 ±0.31)%，(0.82 ±0.15)%，(0.35 ±0.18)%(圖 3)。

2.4 直接免疫熒光

熒光顯微鏡觀察結果顯示，帶有FITC-CD29，FITC-CD73標記的細胞顯示綠色熒光，帶有PE-105，PE-166標記的細胞顯示紅色熒光(圖4)。這與流式細胞檢測高表達的結果一致。

圖3 流式細胞術分析人脂肪間充質干細胞免疫表型Fig 3 Flow cytometry analysis of human adipose derived stem cells

圖4 熒光顯微鏡下的人脂肪間充質干細胞形態(×200)Fig 4 Immunofluorescence images of human adipose derived mesenchymal stem cells

2.5 細胞的分化潛能

2.5.1 成脂誘導分化 對照組細胞形態無明顯變化，油紅染色未見胞質有明顯著色。實驗組細胞在成脂誘導劑的作用下，3 d后光鏡下可見細胞由長梭形變為類圓形，此后細胞質內開始有透亮的脂滴出現，14 d結束誘導時，成脂細胞明顯增多，油紅染色大多數脂滴陽性，呈鮮紅色。見圖5。RT-PCR結果顯示，hADSCs成脂誘導1周和2周后與對照組相比，PPARγ-2 mRNA 表達量均明顯升高(P ＜0.01)，相較于誘導1周組，誘導2周時，PPARγ-2 mRNA水平亦明顯增加(P＜0.01)(圖6a)。

2.5.2 成骨誘導分化 對照組細胞形態無明顯改變，誘導過程中未見明顯鈣沉積。實驗組成骨分化時細胞形態改變明顯，7 d后細胞形態開始變圓，可以觀察到晶瑩類似鈣結節的物質出現，4周后行茜素紅染色可見紅色鈣結節。見圖7。熒光定量PCR結果顯示，與對照組相比，成骨誘導2周和4周后，骨橋蛋白mRNA表達增高(P＜0.01)(圖6b)。在成骨誘導中發現，在一些骨化中心的周圍可見脂滴形成，并逐漸增多，相較成脂分化產生的脂滴，成骨過程中出現的脂滴更大，細胞形態更圓，油紅染色陽性，對照組油紅染色結果陰性。見圖8。RT-PCR結果顯示，與對照組相比，誘導4周和誘導2周時PPARγ-2 mRNA表達明顯增加(P＜0.01)，誘導4周組PPARγ-2 mRNA表達比誘導2周時進一步增加(P ＜0.01)(圖6c)。

圖5 人脂肪間充質干細胞成脂誘導后的形態(油紅O染色×200)Fig 5 Cell morphology of human adipose derived mesenchymal stem cells after adipogenic induction(Oil Red O staining×200)

圖6 hADSCs在成脂成骨分化過程中基因表達的變化Fig 6 Relative gene expression of human adipose derived mesenchymal stem cells during adipogenic induction and osteogenic induction

圖7 人脂肪間充質干細胞成骨誘導后的形態(茜素紅染色×200)Fig 7 Cell morphology of human adipose derived mesenchymal stem cells after osteogenic induction(alizarin red staining×200)

3 討論

圖8 成骨誘導對人脂肪間充質干細胞形態的影響(油紅O染色×200)Fig 8 The effect of osteogenic induction on cell morphology of human adipose derived mesenchymal stem cells(Oil Red O staining×200)

種子細胞已經成為組織工程的一個關鍵因素。近年來，越來越多的報道顯示，hADSCs避免了倫理學限制和移植排斥等問題，且在體外具有高擴增及多向分化能力［10］。這符合 2003 年 Gimble［11］提出的干細胞應用于臨床所需遵守的規則。因為這些優勢，hADSCs具有廣泛的應用前景。自從Zuk等首次從脂肪組織中分離出hADSCs以來［3］，出現了許多hADSCs分離培養方法，但hADSCs的分離純化及鑒定一直是一個難題，同時對其的鑒定方法至今尚未充分建立。因此，高效分離培養及鑒定hADSCs方法的建立顯得十分有價值。

本實驗通過膠原酶消化及貼壁篩選，建立了一種簡單高效的分離培養hADSCs的方法。結果顯示，適當提高膠原酶濃度有助于纖維結締組織與脂肪組織的分離，能提高原代細胞的收獲數量及純度。此外，原代培養hADSCs的脂肪來源十分重要。與內臟脂肪相比，皮下脂肪分離獲得hADSC的成功率更高。原代培養的hADSCs在體外，直到12代均保持較強的增殖及多向分化能力。

我們通過多種細胞表面標志的測定，獲得了純度較高的hADSCs。這些數據排除了造血細胞、內皮細胞污染的可能。同時，hADSCs低表達HLA-DR，提示hADSCs可以通過主要組織相容性復合體限制性應用于臨床［10］。另外，hADSCs的表型在體外經過多次傳代并無明顯改變，提示hADSCs在體外擴增時具有穩定性。

本研究還顯示，hADSCs具有典型的間充質干細胞特性:可向骨細胞、脂肪細胞分化。在成骨分化過程中發現脂滴形成，PPARγ-2 mRNA表達增高，這與Safwani等［12］的近期報道相符。Watters 等［13］在關節炎發病機制的研究中也發現，骨組織再生與脂代謝有關。Boskey等［14］發現，軟骨內骨形成開始，其內三酰甘油含量明顯增加，故三酰甘油類油脂在礦物化形成過程中可能具有重要的作用。Pfeilschifter等［15］報道，纖維蛋白溶酶激活劑及其抑制劑調節骨組織的形成，而進食脂肪可抑制纖維蛋白溶酶的活性。由此可以推測，在礦物化區域產生的三酰甘油類脂滴可能對纖維蛋白溶酶活性有抑制作用，從而促進hADSCs向成骨細胞分化，參與誘導了體外成骨過程的進行，但其確切機制有待深入研究。

總之，我們建立了一種體外分離培養hADSCs的方法，并對細胞進行了較為全面的鑒定。同時發現，在hADSCs體外成骨分化過程中伴隨著成脂的發生，考慮其對成骨具有促進作用。這些結果為hADSCs作為種子細胞被應用于組織工程提供了依據。

［1］ Lennon DP，Caplan AI.Isolation of human marrow-derived mesenchymal stem cells［J］.Exp Hematol，2006，34(11):1604－1605.

［2］ Yoshimura H，Muneta T，Nimura A，et al.Comparison of rat mesenchymal stem cells derived from bone marrow，synovium，periosteum，adipose tissue，and muscle［J］.Cell Tissue Res，2007，327(3):449 －462.

［3］ Zuk PA，Zhu M，Ashjian P，et al.Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells［J］.Mol Biol Cell，2002，12(13):4279 －4295.

［4］ Barry FP，Murphy JM.Mesenchymal stem cells:clinical applications and biological characterization［J］.Int J Biochem Cell Biol，2004，36(4):568 －584.

［5］ Strem BM，Hicok KC，Zhu M，et al.Multipotential differentiation of adipose tissue-derived stem cells［J］.Keio J Med，2005，54(3):132 －141.

［6］ He X，Li YL，Wang XR，et al.Mesenchymal stem cells transduced by PLEGFP-N1 retroviral vector maintain their biological features and differentiation［J］.Chin Med J(Engl)，2005，118(20):1728 －1734.

［7］ Katz AJ，Tholpady A，Tholpady SS，et al.Cell surface and transcriptional characterization of human adipose-derived adherent stromal(hADAS)cells［J］.Stem Cells，2005，23(3):412－423.

［8］ Zuk PA，Zhu M，Mizuno H，et al.Multilineage cells from human adipose tissue:implications for cell-based therapies［J］.Tissue Eng，2001，7(2):211 － 228.

［9］ Maddox JR，Liao X，Li F，et al.Effects of culturing on the stability of the putative murine adipose derived stem cells markers［J］.Open Stem Cell J，2009，1:54 －61.

［10］ Yang XF，He X，He J，et al.High efficient isolation and systematic identification of human adipose-derived mesenchymal stem cells［J］.J Biomed Sci，2011，18:59.

［11］ Gimble JM.Adipose tissue-derived therapeutics［J］.Expert Opin Biol Ther，2003，3(5):705 －713.

［12］ Safwani WK，Makpol S，Sathapan S，et al.Alteration of gene expression levels during osteogenic induction of human adipose derived stem cells in long-term culture［J］.Cell Tissue Bank，2013，14(2):289 －301.

［13］ Watters JW，Cheng C，Pickarski M，et al.Inverse relationship between matrix remodeling and lipid metabolism during osteoarthritis progression in the STR/Ort mouse［J］.Arthritis Rheum，2007，56(9):2999 －3009.

［14］ Boskey AL，Reddi AH.Changes in lipids during matrix:induced endochondral bone formation［J］.Calcif Tissue Int，1983，35(4/5):549 －554.

［15］ Pfeilschifter J，Erdmann J，Schmidt W，et al.Differential regulation of plasminogen activator and plasminogen activator inhibitor by osteotropic factors in primary cultures of mature osteoblasts and osteoblast precursors［J］.Endocrinology，1990，126(2):703 －711.