Hippo-YAP信號通路在人膝骨性關節炎中表達的意義

何正言 梅浩

膝骨關節炎(Knee Osteoarthritis，KOA)是一種常見的關節軟骨退變疾病，其主要表現為關節疼痛、晨僵、腫脹和進行性致畸。KOA的病變主要在于軟骨的退行性改變，而軟骨的退行性改變受各種細胞信號通路及因子的調控，其中Hippo-YAP信號通路是近年來研究的熱點。目前的研究表明，Hippo通路的發現源自于1995年果蠅基因突變表型Wts，2002年發現了 Hippo 通路的三個成員:Salvador、YAP 和 Mats［1］。目前的研究證明［2］，Hippo信號通路是一條較為保守的信號通路，另外有研究證明［3］Hippo信號通路可以調節細胞的增殖和凋亡，檢索國內外文獻均為發現Hippo信號通路在骨關節炎中的研究報道。本文將通過探討骨關節炎與Hippo信號通路的關系，了解Hippo信號通路在骨關節炎發病中的相關機制，為骨關節炎的早期診斷和病情判斷提供臨床實驗數據，并且為進一步的治療和預防提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 實驗對象 ①病例選擇:所有研究對象均來自2010年2月至2012年8月韶關市第一人民醫院骨科。實驗組膝關節KOA患者71例，女32，男39例，平均年齡(67±12)歲(43～79歲)，以上所有患者均經過臨床及關節鏡確診，并且符合1991年美國風濕協會制定的Altman診斷標準。對照組為我院健康體檢者29例，無KOA病史，膝關節透視檢查正常，女13例，男16例，平均年齡(45±26)歲(26～78歲)。所有試驗對象均在行關節鏡檢查前行關節穿刺，并與其簽署知情同意書。②實驗標本:兩組的滑液均在行膝關節腔穿刺時留取，在抽取關節滑液時，先用1 ml的生理鹽水沖洗關節腔，待沖洗完全后抽取1.5 ml。留取的關節滑液標本均離心后取上清，置于-20℃冰箱保存備用。

1.2 材料和方法 ①主要儀器:普通冰箱(中國海爾)，HHW電熱恒溫水浴箱(金壇市醫療器械廠)，ELX800酶標分析儀(美國Bio-Tec公司)。②主要試劑:Hippo-YAP抗體試劑盒購自Abcam公司，編號:ab124474。抑制凋亡蛋白BCL-2抗體試劑盒購自上海恒斐生物科技有限公司，編號:BY-5134R。③ELISA試驗方法:將96孔板最上面一排的8孔作為標準孔，反復對倍稀釋各孔，最后一個孔作為空白孔，建立標準曲線;加入待測樣品100 μl，37℃反應90 min;0.01 m PBS洗板三次，濾紙印干;加入 Hippo-YAP-1(BCL-2)一抗 100 μl，37℃反應60 min;0.01 m PBS洗板三次，每次浸泡三分鐘，濾紙印干;加入酶標液100 μl，37℃反應 30 min;0.01 m PBS 洗板五次，每次浸泡兩分鐘，濾紙印干;加入底物 TMB90 μl，置37℃暗處反應5～10 min;每孔加入一滴終止液混勻，當藍色轉為黃色時上機檢測;酶標儀設定450nm處測定吸光值。

1.3 統計學方法 所有數據均輸入計算機，用SPSS 19.0版本軟件進行統計學處理。計量資料以均數±標準差表示，以P＜0.05確定為差異有統計學意義。

2 結果

實驗組與對照組的滑液中YAP與BCL-2的表達水平作單因素方差分析，結果見表1。YAP的實驗組與對照組比較有統計學意義P＜0.01，KOA患者的滑液中YAP的水平顯著高于對照組。BCL-2的實驗組與對照組比較有統計學意義P＜0.01，KOA患者的滑液中BCL-2的水平顯著低于對照組。

實驗組中YAP與BCL-2水平作Spearman相關分析，相關系數為r=0.921(P＜0.01)，兩者呈正相關。

表1 關節滑液中PD-1及NO檢測結果()

表1 關節滑液中PD-1及NO檢測結果()

注:*與對照組比較有統計學意義(P＜0.01)

組別 例數 YAP(pg/ml) BCL-2(pg/ml)實驗組 71 42.18±133.54* 33.13±19.21*對照組29 254.12±28.12 194.11±21.61

3 討論

膝骨關節炎在中老年人疾病中較為常見，其發病原因與關節軟骨細胞的退變、凋亡有關，軟骨細胞在骨關節炎的發病過程中的變化受內環境中各種細胞信號通路及細胞因子的影響。骨關節炎的病理生理變化主要表現為關節軟骨組織的合成與分解代謝失衡，如軟骨細胞過度成熟而導致骨贅的形成、關節間隙變小，另一方面軟骨細胞破壞過多、退化及萎縮而致關節滑液少、軟骨彈性低及關節僵硬［4］。本文以下將對滑液中檢測到的Hippo-YAP與BCL-2表達水平在KOA中的可能機制及它們的相關關系展開討論。

3.1 Hippo-YAP與KOA的關系 Hippo-YAP信號通路是一條較為保守的信號轉導通路，其中YAP蛋白是銜接Hippo信號通路上下游因子的重要蛋白，YAP主要是負責從細胞膜到細胞核的信號傳導［5］。有研究表明在腫瘤細胞中抑制Hippo信號通路可以使得腫瘤細胞過度增殖分化，并且其中檢測到Yki蛋白高表達，而在正常細胞中抑制Hippo信號通路可使得細胞增殖緩慢，說明Hippo信號通路對細胞增殖起正調控的作用，而對腫瘤細胞起篩選的抑制作用［6］。YAP是Hippo通路的主要效應因子，近年來的研究表明YAP對細胞起促進增殖分化的作用［7］。本實驗研究中我們發現實驗組KOA患者膝關節滑液較對照組顯著高表達YAP蛋白，提示了KOA的發病過程中YAP高表達，其可能是病程中YAP介導了軟骨細胞凋亡，促進細胞程序性死亡，文獻中表明Hippo通路的YAP蛋白與細胞的增殖呈正相關［8］，而本研究中實驗組的較老的兩例患者的 YAP較低(79歲 =60.73 pg/ml，77歲 =61.11 pg/ml)，其可能是原因是骨關節炎早期時軟骨細胞主要表現過度成熟、增生及骨贅的形成，而晚期時表現為軟骨退化、萎縮。KOA患者的滑液中BCL-2的水平顯著低于對照組，而在正常人中表達較高，其可能的原因是BCL-2在凋亡與抗凋亡平衡中起抗凋亡作用，與文獻相符［9］。

3.2 Hippo-YAP信號通路與凋亡的關系 Hippo-YAP信號通路主要通過接受細胞膜上FAT4膜蛋白受體上的信號，從而通過各種膜蛋白傳導給YAP，YAP進而將抗凋亡信號轉導給細胞核，而細胞核指導各種抗凋亡因子的作用，如BCL-2、AKT、caspase-3等［10］。本研究的結果表明，KOA 患者的滑液中BCL-2的濃度顯著低于對照組，提示了KOA的發病過程中關節滑液BCL-2濃度顯著降低。KOA患者滑液里YAP與BCL-2呈正相關，近年來的研究證明BCL-2為抗凋亡因子之一，本研究發現YAP與BCL-2呈正相關關系，進一步說明了YAP蛋白可能為抗凋亡因子，因此YAP可能是KOA發病過程中促進關節軟骨凋亡的重要因子。

3.3 展望 本實驗因為晚期樣本量的限制未將實驗組的早中期和晚期的患者進行分組研究，而進一步的實驗可對形成骨贅的骨關節炎和軟骨退變的骨關節炎進行分組研究Hippo-YAP信號通路，其可進一步的研究骨關節炎發病中Hippo-YAP信號通路的機制。綜上所述，Hippo-YAP信號通路可能是軟骨細胞的抗凋亡過程，深入探討Hippo-YAP信號通路在骨關節炎中的各種促進機制將有可能建立骨關節炎新的治療靶點。

［1］Zhao B，Lei QY，Guan KL.The Hippo-YAP pathway:new connections between regulation of organ size and cancer.Curr Opin Cell Biol，2008，20(6):638-646.

［2］Tsai BP，Hoverter NP，Waterman ML.Blending Hippo and WNT:SharingMessengers andRegulation.Cell， 2012，151(7):1401-1403.

［3］Tumaneng K，Schlegelmilch K，Russell RC，et al.YAP mediates crosstalk between the Hippo and PI(3)K-TOR pathways by suppressing PTEN via miR-29.Nat Cell Biol，2012，14(12):1322-1329.

［4］Kutzner I，Heinlein B，Graichen F，et al.Loading of the knee joint during ergometer cycling:telemetric in vivo data.J Orthop Sports Phys Ther，2012，42(12):1032-1038.

［5］Yu FX，Mo JS，Guan KL.Upstream regulators of the Hippo pathway.Cell Cycle，2012，11(22):4097-4098.

［6］George NM，Day CE，Boerner BP，et al.Hippo signaling regulates pancreas development through inactivation of Yap.Mol Cell Biol，2012，32(24):5116-5128.

［7］Tremblay AM，Camargo FD.Hippo signaling in mammalian stem cells.Semin Cell Dev Biol，2012，23(7):818-826.

［8］Konsavage WM Jr，Yochum GS.Intersection of Hippo/YAP and Wnt/β-catenin signaling pathways.Acta Biochim Biophys Sin(Shanghai)，2013，45(2):71-79.

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［10］Kammouni W，Wong K，Ma G，et al.Regulation of apoptosis in fibroblast-like synoviocytes by the hypoxia-induced Bcl-2 family member Bcl-2/adenovirus E1B 19-kd protein-interacting protein 3.Arthritis Rheum，2007，56(9):2854-2863.