清肺消炎丸對COPD大鼠肺組織MMP-9和TIMP-1表達的影響

劉恩順 劉 偉 孫增濤 蘇景深 關 鵬

（天津中醫藥大學第二附屬醫院呼吸科，天津，300150）

實驗研究

清肺消炎丸對COPD大鼠肺組織MMP-9和TIMP-1表達的影響

劉恩順 劉 偉 孫增濤 蘇景深 關 鵬

（天津中醫藥大學第二附屬醫院呼吸科，天津，300150）

目的：觀察清肺消炎丸對COPD大鼠肺組織中基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）及基質金屬蛋白酶組織抑制因子-1（TIMP -1）表達的影響。方法：將30只Wistar大鼠，隨機分為3組，正常對照組、COPD模型組和清肺消炎丸組，除正常對照組外，采用煙熏及內窺鏡下氣管滴入內毒素方法制作COPD模型，造模成功后分別治療7 d，觀察各組肺組織中MMP-9和TIMP-1表達變化。結果：模型組大鼠肺組織MMP-9和TIMP-1的表達與空白組相比明顯增強（P＜0.05），中藥治療組大鼠肺組織MMP-9和TIMP-1水平比模型組減低（P＜0.05）。結論：清肺消炎丸具有抑制COPD大鼠肺組織中MMP-9及TIMP-1的表達，改善MMP-9／TIMP-1比例失衡，從而防治該病氣道重塑的作用。

清肺消炎丸；慢性阻塞性肺疾病；急性發作期；MMP-9；TIMP-1

慢性阻塞性肺部疾病（Chronic Obstructive Pulmonary Disease，COPD）的病理以肺泡壁進行性破壞，肺泡擴張為其特征性改變。大量實驗研究證實，蛋白酶／抗蛋白酶的失衡是其主要原因之一。近年來基質金屬蛋白酶（MMP-9）及基質金屬蛋白酶組織抑制因子（TIMP-1）失衡漸漸受到重視。本實驗擬通過觀察清肺消炎丸治療對COPD大鼠肺組織中MMP-9、TIMP -1表達的影響，探討其干預COPD大鼠氣道重構的作用和機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 清潔級健康Wistar大鼠30只，雄性，體重250～300 g，天津中醫藥大學實驗動物中心提供。

1.1.2 藥物 清肺消炎丸由天津中新藥業達仁堂制藥廠生產。

1.1.3 試劑及儀器 內毒素（美國Sigma公司），大前門牌過濾嘴香煙（上海卷煙廠生產），兔抗鼠MMP-9和TIMP-1及SABC免疫染色試劑盒、DAB顯色試劑盒（棕黃色），均為武漢博士德生物工程有限公司生產。OLYMPUS CX—31顯微鏡為日本OLYMPUS光學儀器有限公司生產。JVC數碼相機為日本JVC公司生產。HMIAS-2000高清晰度彩色醫學圖文分析系統由武漢千屏影像技術有限責任公司生產。

1.2 方法

1.2.1 COPD模型的建立 采用煙熏及內窺鏡下氣管滴入內毒素造模法制造COPD大鼠模型［1］。除正常對照組呼吸正常空氣外，其他各組大鼠每天上午在自制的密閉箱內熏大前門牌香煙霧0.5 h。在實驗開始第1 d和第14 d時，各組大鼠均用乙醚麻醉，除正常對照組在硬式鼻腔鏡引導下經聲門緩慢滴入200 μL生理鹽水外，200 μL內毒素水溶液（1 mg／mL），當日不予被動吸煙。連續熏煙4周后，造成慢性阻塞性肺疾病模型。

1.2.2 實驗分組及給藥 將Wistaer大鼠隨機分為3組，每組10只。（1正常對照組：灌服生理鹽水1 mL／100g，1次／d，灌服7 d；（2模型對照組：灌服生理鹽水1 mL／100 g，1次／d，灌服7 d；（3清肺消炎丸組：每天灌服量1 mL／100 g，以含清肺消炎丸量為：1.56 g／kg，1次／d，灌服7 d。3組均在停止煙熏的第2 d開始灌藥。

1.2.3 石蠟切片與免疫組化 灌藥結束后的第2 d，10%水合氯醛腹腔麻醉后，取出肺組織并置于福爾馬林溶液中常規固定后，各大鼠肺組織行常規石蠟切片，片厚5 μm。各切片脫蠟至水，采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化酶法（武漢博士德公司，SP即用型試劑盒）在石蠟切片上測MMP-9和TIMP-1的免疫組化表達，一抗為1∶100 MMP-9和TIMP-1多克隆抗體，二抗為生物素山羊抗兔IgG，陰性對照標本除以PBS代替一抗外，其他步驟與被測標本相同，DAB室溫顯色，陽性反應為胞質中出現棕黃色顆粒。

1.2.4 照相及圖像分析 每只大鼠的免疫組化標本隨機選取5個視野；400倍光鏡下進行觀察。用JVC數碼相機在400倍下照相，用HMIAS-2000高清晰度彩色醫學圖文分析系統對各切片在400倍下進行圖像分析，每張切片的周圍隨機選擇5個計算機視野，測定各組有MMP-9和TIMP-1陽性反應物質的光密度，結果以均數±標準差表示。平均光密度反應某物質吸收光的程度，被測結構顏色越深，平均光密度值則越大。

1.2.5 統計學分析 全部數據用SPSS 13.0統計軟件處理，組間比較用方差分析，兩兩比較用LSD檢驗。

2 結果

2.1 大鼠肺組織基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）的檢測結果 MMP-9在正常對照組，肺組織中僅見微量的表達，在模型組肺組織中可見到強陽性表達。模型組肺組織中的表達明顯強于正常對照組，但清肺消炎丸組明顯弱于模型組，見圖1。

2.2 大鼠肺組織金屬蛋白酶組織抑制因子-1（TIMP -1）檢測結果 TIMP-1在正常對照組肺組織中僅見微量的表達，在模型組的肺組織中可見到強陽性表達。模型組肺組織中的表達明顯強于正常對照組，但清肺消炎丸組明顯弱于模型組，見圖2。

圖1 3組大鼠肺組織中MMP-9表達情況

圖2 3組大鼠肺組織中TIMP-1表達情況

2.3 3組大鼠肺組織MMP-9、TIMP-1陽性細胞的平均吸光度值比較，見圖3。

圖3 大鼠肺組織MMP-9、TIMP-1陽性細胞科均吸光度值

3 討論

由于遺傳因素或炎癥細胞和遞質的作用，肺內源性蛋白酶和抗蛋白酶失衡，構成肺泡壁的細胞外基質（ECM）受損是肺氣腫性破壞的主要機制［2-4］。正常情況下構成肺泡壁的細胞外基質（ECM）處于合成與降解的動態平衡，蛋白酶分泌增加和／或抗蛋白酶合成減少均可致細胞外基質受損。MMP-9和TIMP-1的動態平衡，目前被認為是反映氣道組織破壞與修復動態平衡的標志［5-7］。COPD患者由于炎癥刺激促使的炎性細胞的增加，產生蛋白酶增加，活性增強，當超過抗蛋白酶的數量及活性時，引起彈性纖維的破壞，促使了肺氣腫的形成［8］。

基質金屬蛋白酶類（MMPs）是一組由鈣離子激活的含鋅離子的內肽酶家族，幾乎能降解細胞外基質的所有成份，其主要由巨噬細胞、中性粒細胞、內皮細胞等合成與分泌。在炎癥、創口愈合、腫瘤浸潤等疾病過程中有重要作用［9-12］。MMP-9即明膠酶B，其主要作用為降解彈力纖維、明膠、及Ⅳ、V型膠原。其參與COPD的發病機制主要是通過破壞肺泡基質成分，使肺泡結構破壞，形成肺氣腫及參與氣道重塑而導致氣流阻塞［13］。Kang等［14］報道，肺實質MMP-9的表達與吸煙有明顯的相關性，并且其表達水平與FEV1呈負相關。本實驗發現COPD模型組大鼠肺組織中MMP-9的表達明顯增強，證實了其參與了COPD的發生和發展。

TIMPs是MMPs的內源性天然抑制因子，廣泛分布于組織和體液中，其主要作用為促進細胞外基質（ECM）沉積和抑制其降解，并類似生長因子可促進平滑肌細胞、表皮細胞等增生。TIMP-1是所有亞類中活性最強的，其特異性抑制MMP-9活性，能被多種細胞因子誘導產生［14-15］。Vegnol等［16］在患者痰中發現MMP-9和TIMP-1含量顯著高于健康人，MMP-9／TIMP-1則低于正常人，且這一比值與第1秒用力呼氣容積呈正相關，表明MMP-9／TIMP-1失衡是引起COPD的一個重要機制之一。本實驗結果顯示COPD模型組大鼠肺組織中TIMP-1的蛋白表達也明顯增強，其可能是由于病理因素刺激下MMP-9增多，使降解細胞外基質增多，從而做出的反饋的應答，以避免組織破壞過度。

我們在多年的臨床實踐中發現COPD急性發作期患者，以“痰熱郁肺”之證多見，故擬用“清熱宣肺平喘”法，以達到“清痰熱、宣肺氣、平氣喘”的作用。清肺消炎丸由《傷寒論》中的麻杏石甘湯為基礎化裁而來，主要藥物包括：麻黃，石膏，杏仁，地龍，牛蒡子，葶藶子，牛黃，羚羊角等。方中麻黃宣肺平喘，被譽為“治喘圣藥”；石膏，牛黃，羚羊角清熱化痰，其中石膏配麻黃，清宣肺中郁熱而起到平喘之功效；杏仁，牛蒡子宣降肺氣，協同麻黃以治咳喘；地龍平喘通絡，諸藥合用，功效將至。

基于本實驗的結果我們認為：在慢性阻塞性肺部疾急性發作期，以TIMP-1相對增高而導致MMP-9／TIMP-1失衡為特征，進而引起以反饋性的細胞外基質沉積和氣道重塑為主的病理變化可能是該病發展過程中的重要階段，也是影響疾病轉歸的重要因素之一。在清熱宣肺平喘法指導下運用清肺消炎丸進行干預，發現清肺消炎丸治療后大鼠MMP-9和TIMP-1的表達均明顯下降，且以抑制TIMP-1的表達更為顯著。提示通過對MMP-9和TIMP-1的抑制，從而使肺臟基質的降解減少，同時可以防止肺泡外基質過度增生，減輕氣道重塑，可能是該治法指導下用藥干預COPD的作用機制之一。

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（2013-01-03收稿）

Effect of Qingfei Xiaoyan Pills on the Expression of MMP-9 and TIMP-1 in the Lung Tissue of COPD Rats

Liu Enshun，Liu Wei，Sun Zengtao，Su Jingshen，Guan Peng
（The Second Affiliated Hospital of Tianjin University of TCM，Tianjn 300150，China）

Objective：To observe the effect of Qingfei Xiaoyan Pills on the expression of matrix metalloproteinase-9（MMP-9）and tissue inhibitor of metalloproteinase-1（TIMP-1）in the lung tissue of COPD Rats.Methods：Thirty Wistar rats were divided into 3 groups randomly，normal control group，COPD model group，Qingfei Xiaoyan Pills group.Except for the normal control group，we made the COPD model by smudging plus intratracheal instillation of LPS under endoscopy，and treated them separately for 7days.Then we observed the change of MMP-9 and TIMP-1 expression in the lung tissue.Results：The MMP-9and TIMP-1 expression in the lung of COPD model group were obviously increased than those of control group（P＜0.05），the MMP-9 and TIMP-1 of Qingfei Xiaoyan Pills group were lower than those of model group（P＜0.05）.Conclusion：Qingfei Xiaoyan Pills could inhibit the expression of MMP-9 and TIMP-1 in the lung in COPD rats，improve the MMP-9／TIMP-1 imbalance，thus playing a role in preventing and treating airway remodeling in COPD.

Qingfei Xiaoyan Pills；COPD；Acute exacerbation；MMP-9；TIMP-1

10.3969／j.issn.1673-7202.2013.06.021