日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原誘導B10細胞產生的研究

田 芳，胡雪莉，楊維平，錢 莉，魏 慧，劉 浩，潘興元，季明春

根據B細胞分泌的細胞因子不同，可以將B細胞分為效應性B細胞亞群和調節性B細胞亞群［1］。調節性B細胞能夠分泌IL－10或TGFβ－1，分別稱為B10細胞和Br3細胞［2－4］。調節性B細胞在自身免疫病、慢性炎癥、腫瘤及寄生蟲感染等疾病中發揮著重要的作用［5－6］。近年來研究提示曼氏血吸蟲感染可以誘導能夠產生IL－10的調節性B細胞產生，這些細胞能阻止過敏性炎癥反應［7－9］。日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原（SEA）和成蟲抗原（SWAP）是血吸蟲感染過程中最主要的兩種抗原成分［10］，但是關于SEA和SWAP是否能夠誘導調節性B細胞產生尚未見報道。本研究通過體外體內兩種途徑，探討了SEA和SWAP是否能誘導調節性B細胞產生，為進一步探討SEA在誘導免疫反應中的作用，及其誘導機體特異性免疫應答下調的機制提供了參考依據。

1 材料方法

1.1 實驗動物 C57BL/6J小鼠，6～8周齡，雌性，購自揚州大學實驗動物研究中心。

1.2 抗原制備 日本血吸蟲成蟲或蟲卵適量，在冰上用組織勻漿器勻漿20 min，－70℃凍存后，取出室溫（22℃）融化，反復4～5次后再置4℃冷浸24 h（中間拿出搖勻），4℃，10 000 r/min離心20 min，用0.22μm濾器（Millipore Co.，USA）過濾上清，－20℃凍存，制成可溶性成蟲抗原（SWAP）和可溶性蟲卵抗原（SEA）。

二辛可寧酸（Bicinchoninic acid，BCA）蛋白檢測試劑盒（Pierce Biotechnology，Inc.，IL，USA）檢測抗原濃度。LPS購自sigma公司。

1.3 體外實驗

1.3.1 體外刺激小鼠脾細胞和脾臟B細胞 正常小鼠剖殺后無菌取脾臟，制備脾臟單個核細胞或用CD19＋磁珠（Miltenyi）分選CD19＋B細胞，均用完全RPMI 1640調整細胞為2×106/m L，每孔1 m L細胞懸液于24孔培養板中，分別用SEA（20μg/m L）、SWAP（10μg/m L）和LPS（10μg/m L）刺激共培養，并設空白對照，置于37℃、5%CO2孵箱中培養，72 h后收集細胞和上清。

1.3.2 調節性B細胞分泌IL－10水平的檢測 用小鼠ELISA試劑盒（達科為公司）檢測不同抗原刺激后細胞培養上清中IL－10水平，按照試劑盒操作說明書進行。將不同稀釋度的標準品以及待測樣本加入反應孔，每個樣品作雙復孔。根據不同濃度下標準品的吸光度值繪制標準曲線，再根據待測培養上清的吸光度值換算細胞因子的濃度。

1.3.3 細胞內因子IL－10的檢測 檢測細胞內因子IL－10水平，取抗原刺激后的B細胞，加入PMA（1μg/m L）和ionomycin（50μg/m L）37 ℃，5%CO2細胞培養箱中培養1 h，每100μL反應體系加入BFA 2μL，37℃，5%CO2細胞培養箱中培養5 h。收集培養細胞，經Cytofix/cytoperm（BD公司）固定通透細胞后，加入PE標記的抗小鼠IL－10（eBscience公司），陰性對照管加PE標記的同型對照抗體，4℃避光孵育30 min，洗滌后重懸于500 μL PBS中，經流式細胞儀（FACS，Calibur）檢測。

1.3.4 細胞表面協同刺激分子的檢測 收集體外刺激后的小鼠B細胞，加入PE標記的抗小鼠CD80、CD86和 CD40（eBscience公司），設空白對照，4℃避光孵育30 min，洗滌后重懸于500μL PBS中，經FACS檢測。

1.4 體內實驗

1.4.1 SEA和SWAP致敏小鼠模型建立 SEA（50μg）、SWAP（50μg）和PBS分別于不完全弗氏佐劑（IFA，sigma）1∶1等體積混合，腹股溝皮下單點免疫，每組6只小鼠，每只小鼠0.1 m L/次，隔1周免疫1次，共免疫3次，于末次免疫后2周剖殺小鼠。無菌取脾臟，制備單個核細胞，一部分細胞用于流式分析胞內因子，另一部分細胞磁珠分選B細胞，同體外實驗相同SEA、SWAP、LPS分別刺激，置于37℃、5%CO2孵箱中培養，72 h后收集細胞培養上清。

1.4.2 調節性B細胞分泌IL－10水平的檢測 取B細胞培養上清，按步驟1.3.2用ELISA試劑盒檢測B細胞分泌細胞因子IL－10水平。

1.4.3 細胞內因子IL－10的檢測 檢測細胞內因子IL－10水平，取脾臟單個核細胞，加入PMA（1 μg/m L）和ionomycin（50μg/m L）37℃，5%CO2細胞培養箱中培養1 h，每100μL反應體系加入BFA 2μL，37℃，5%CO2細胞培養箱中培養5 h。收集培養細胞，加入 APC標記的抗小鼠CD19（eB－science公司），4℃避光孵育30 min，洗滌細胞，加入Cytofix/cytoperm固定通透細胞后，加入PE標記的抗小鼠IL－10，陰性對照管加PE標記的同型對照抗體，4℃避光孵育30 min，洗滌后重懸于500 μL PBS中，經FACS檢測。

1.5 統計分析 所有數據用SPSS13.0進行統計分析，計量資料用均值±標準誤（SEM）表示。用單因素方差分析（One－way ANOVA）比較各組之間的差異，P＜0.05認為有統計學差異。

2 結 果

2.1 體外誘導小鼠脾臟單個核細胞分化為B10細胞的情況 SEA體外刺激小鼠脾臟單個核細胞，SEA和LPS刺激組CD19＋IL－10＋B細胞的比例顯著高于SWAP刺激組和空白對照組（P＜0.01）（圖1）。

圖1 SEA、SWAP和LPS體外刺激小鼠脾臟單個核細胞分化為CD19＋IL－10＋B細胞的比例Fig.1 The CD19＋IL－10＋ B cells ratio in mouse spleen mononuclear cells stimulated by SEA，SWAP and LPS

2.2 體外誘導小鼠脾臟B細胞分泌IL－10的水平

體外分選脾臟B細胞，用不同抗原刺激，結果發現（圖2），SEA和LPS體外能夠刺激脾臟B細胞分泌IL－10，顯著高于SWAP刺激組和空白對照組（P＜0.01）。

2.3 體外誘導小鼠脾臟B細胞分化為B10細胞的情況 SEA、SWAP和LPS體外刺激小鼠脾臟B細胞，SEA刺激組IL－10＋B細胞的比例顯著高于SWAP刺激組和空白對照組（P＜0.01），而與LPS

刺激組無顯著性差異（圖3）。

2.4 體外對小鼠脾臟B細胞活化的影響 結果顯示，SEA和LPS體外刺激小鼠脾臟B細胞可以誘導B細胞表達細胞活化性受體CD80、CD86和CD40，而SWAP 不能誘導其活化（P＜0.01）（圖4）。

圖2 SEA、SWAP和LPS體外刺激小鼠脾臟CD19＋B細胞培養上清中IL－10水平Fig.2 Cytokines IL－10 levers in mouse spleen CD19＋B cells cultured supernatants stimulated by SEA，SWAP and LPS（n＝6；＊P＜0.05；＊＊P＜0.01）

圖3 SEA、SWAP和LPS體外刺激小鼠脾臟CD19＋B細胞分化為IL－10＋B細胞的比例Fig.3 IL－10＋ B cells ratio in mouse spleen CD19＋B cells stimulated by SEA，SWAP and LPS

2.5 體內誘導小鼠脾臟B細胞分泌IL－10的水平結果發現（圖5），SEA能夠誘導脾臟B細胞分泌IL－10，顯著高于SWAP和PBS免疫組（P＜0.05）。表明SEA體內可以刺激小鼠脾臟B細胞分泌IL－10。

2.6 體內誘導小鼠B10細胞產生的情況 結果發現，SEA免疫組能夠顯著誘導CD19＋IL－10＋B細胞產生比例顯著高于SWAP和PBS免疫組（P＜0.01）。表明SEA 體內能夠誘導小鼠 CD19＋IL－10＋B細胞產生（圖6）。

3 討 論

血吸蟲病是一種典型的慢性感染性、免疫性疾病，在血吸蟲感染過程的不同時期機體免疫系統針用的細胞，其起源以及確切的分化途徑還不十分清楚。調節性B細胞發揮抑制功能可以通過分泌對血吸蟲各發育階段的不同抗原產生不同的優勢應答。目前認為，在血吸蟲感染過程中，首先宿主體內以Th1型細胞免疫應答為主，當蟲體繼續發育并且產生蟲卵后，Th2型細胞免疫應答出現并逐漸增強。Th1型免疫反應尤其是IFN－γ與宿主抗血吸蟲感染的保護性免疫力相關，而Th2型免疫反應雖然能夠誘導蟲卵肉芽腫，抑制蟲卵對肝臟的損害，但不利于機體對蟲體的清除［10－11］。這種Th1向Th2免疫反應的極化除了與蟲體抗原種類有關外，宿主的免疫系統也發揮著重要的免疫負調控作用。其中CD4＋CD25＋Foxp3＋T細胞（Treg）在血吸蟲感染過程中就發揮著重要的負向調節作用［12－13］。

圖4 SEA、SWAP和LPS體外刺激小鼠脾臟CD19＋B細胞表面CD80、CD86和CD40的表達水平Fig.4 Expression of CD80，CD86 and CD40 on mouse spleen CD19＋B cells stimulated by SEA，SWAP and LPS

圖6 SEA、SWAP和PBS體內免疫小鼠后脾臟CD19＋IL－10＋B細胞的比例Fig.6 The CD19＋IL－10＋ B cells ratio in mouse spleen mononuclear cells immunized by SEA，SWAP and PBS

調節性B細胞也是一群重要的發揮負向調節作IL－10或TGF－β調控 Th1/Th2平衡，抑制炎癥的進展或促進炎癥疾病模型的痊愈，還可以通過MHC分子和B7分子調控和誘導 Treg的產生［14－16］。有研究表明在曼氏血吸蟲感染小鼠后，脾臟中產生IL－10的CD1dhigh調節性B細胞產生，這群B10細胞可以通過分泌IL－10和Treg抑制氣道過敏性炎癥反應［7－9］。血吸蟲感染后，在宿主體內有兩類重要抗原即成蟲抗原（SWAP）和蟲卵抗原（SEA），是研究血吸蟲疾病模型的工具抗原，而且SWAP和SEA兩種抗原本身即可用來建立特定的免疫實驗模型并已被廣泛應用。但目前仍不清楚是否這兩種抗原都能夠誘導調節性B細胞產生，及誘導產生調節性B細胞的機制如何。

實驗結果表明，SEA在體外可以誘導小鼠脾臟單個核細胞分化為B10細胞，而SWAP不能發揮作用。我們進一步體外分選了脾臟CD19＋B淋巴細胞進行抗原刺激，排除了脾臟單個核細胞中其他免疫細胞的影響，結果表明，SEA能夠活化脾臟B細胞，并且能刺激脾臟B細胞分化為B10細胞，分泌IL－10，而SWAP沒有同樣的作用。體內實驗同樣表明SEA免疫后可以誘導小鼠脾臟單個核細胞分化為B10細胞。因此我們認為，SEA是主要誘導調節性B細胞（B10）產生的主要抗原。也有研究也表明，曼氏血吸蟲感染小鼠后，主要是在感染的慢性期才能誘導分泌IL－10的B細胞產生，并且發揮抵抗過敏性氣道炎癥的作用［17］。因此，可能在感染的慢性期，蟲卵產生后由SEA發揮了誘導B10細胞產生的作用。

本研究表明，日本血吸蟲蟲卵抗原在體內體外均能誘導調節性B細胞（B10）產生，并且在體外誘導B10細胞時不依賴于其他免疫細胞的存在。而這群B10細胞的活化機制和對Th1、Th2、Treg細胞的作用如何是需要我們進一步研究的內容。通過我們的研究，為建立以SEA抗原為工具的免疫研究模型、并且在自身免疫性疾病領域中的廣泛應用提供了理論依據，為血吸蟲病候選疫苗分子的篩選提供了免疫學依據。

［1］Lund FE.Cytokine－producing B lymphocytes－key regulators of immunity［J］.Curr Opin Immunol，2008，20：332－338.DOI：10.1016/j.coi.2008.03.003

［2］Lund FE，Garvy BA，Randall TD，et al.Regulatory roles for cytokine－producing B cells in infection and autoimmune disease［J］.Curr Dir Autoimmun，2005，8：25－54.DOI：10.1159/000082086

［3］Noh G，Lee JH.Regulatory B cells and allergic diseases［J］.Allergy Asthma Immunol Res，2011，3：168－177.DOI：10.4168/aair.2011.3.3.168

［4］Bouaziz JD，Le Buanec H，Saussine A，et al.IL－10producing regulatory B cells in mice and humans：state of the art［J］.Curr Mol Med，2012，12：519－527.

［5］Mauri C，Ehrenstein MR.The＇short＇history of regulatory B cells［J］.Trends Immunol，2008，29：34－40.DOI：10.1016/j.it.2007.10.004

［6］Berthelot JM，Jamin C，Amrouche K，et al.Regulatory B cells play a key role in immune system balance［J］.Joint Bone Spine，2012，80：18－22.DOI：10.1016/j.jbspin.2012.04.010

［7］Mangan NE，Fallon RE，Smith P，et al.Helminth infection protects mice from anaphylaxis via IL－10－producing B cells［J］.J Immunol，2004，173：6346－6356.

［8］Amu S，Saunders SP，Kronenberg M，et al.Regulatory B cells prevent and reverse allergic airway inflammation via FoxP3－positive T regulatory cells in a murine model［J］.J Allergy Clin Immunol，2010，125：1114－1124.DOI：10.1016/j.jaci.2010.01.018

［9］van der Vlugt LE，Labuda LA，Ozir－Fazalalikhan A，et al.Schistosomes induce regulatory features in human and mouse CD1d（hi）B cells：inhibition of allergic inflammation by IL－10 and regulatory T cells［J］.PLoS One，2012，7：e30883.DOI：10.1371/journal.pone.0030883

［10］Dunne DW，Cooke A.A worm＇s eye view of the immune system：consequences for evolution of human autoimmune disease［J］.Nat Rev Immunol，2005，5：420－426.DOI：10.1038/nri1601

［11］Gaber HM，Maghraby AS，Ahmed MB，et al.Immune responses in mice after immunization with antigens from different stages of the parasite Schistosoma mansoni［J］.Z Naturforsch C，2010，65：289－302.

［12］Yang J，Zhao J，Yang Y，et al.Schistosoma japonicumegg antigens stimulate CD4CD25Tcells and modulate airway inflammation in a murine model of asthma［J］.Immunology，2007，120：8－18.DOI：10.1111/j.1365－2567.2006.02472.x

［13］Mo HM，Liu WQ，Lei JH，et al.Schistosoma japonicumeggs modulate the activity of CD4＋CD25＋Tregs and prevent development of colitis in mice［J］.Exp Parasitol，2007，116：385－389.DOI：10.1016/j.exppara.2007.02.009

［14］Mizoguchi A，Bhan AK.A case for regulatory B cells［J］.J Immunol，2006，176：705－710.

［15］Nikolajczyk BS.B cells as under－appreciated mediators of nonauto－immune inflammatory disease［J］.Cytokine，2010，50：234－242.DOI：10.1016/j.cyto.2010.02.022

［16］Sun JB，Flach CF，Czerkinsky C，et al.B lymphocytes promote expansion of regulatory T cells in oral tolerance：powerful induction by antigen coupled to cholera toxin B subunit［J］.J Immunol，2008，181：8278－8287.

［17］Smits HH，Hammad H，van Nimwegen M，et al.Protective effect of Schistosoma mansoni infection on allergic airway inflammation depends on the intensity and chronicity of infection［J］.J Allergy Clin Immunol，2007，120：932－940.DOI：10.1016/j.jaci.2007.06.009