醫用小型豬骨加工工藝與免疫原性的檢測與分析※

周小垚 顧翔風 柳伯安 孔繁平 趙 蓉 張繼英 余奇文 張冬青

醫用小型豬骨加工工藝與免疫原性的檢測與分析※

周小垚1顧翔風1柳伯安1孔繁平1趙 蓉2張繼英2余奇文2張冬青2

目的制備醫用小型豬骨的浸出性異種蛋白，檢測和分析其皮質和松質混合骨（以下簡稱混合骨）與單純皮質骨（以下簡稱皮質骨）浸出性異種蛋白刺激和誘導人淋巴細胞增殖的應答反應。方法應用化學和物理學方法制備獲得醫用小型豬混合骨與皮質骨粉，以定量RPMI-1640攪拌和浸泡4℃ 72h后高速離心獲取上清液且進行蛋白定量檢測；隨即應用CCK-8方法檢測和分析混合骨與皮質骨浸出性異種蛋白刺激和誘導人外周血淋巴細胞增殖的差異性；以及人外周血淋巴細胞增殖培養上清中四種細胞因子表達的異同。結果CCK-8實驗結果表明：CCK-8實驗未見混合骨與皮質骨浸出性異種蛋白具有刺激和誘導人淋巴細胞增殖的應答反應的統計學差異；而應用ELISA酶聯免疫吸附實驗對人淋巴細胞培養上清中IFN-r、IL-1、IL-10和TNF-a的檢測結果提示：與對照組相比，經工藝處理后小型豬骨組的四種炎癥相關因子均較處理前組具有統計學的顯著性差異（P＜0.05），而皮質骨組較混合骨組其炎癥相關因子的表達同樣具有統計學差異。結論本實驗結果提示，應用已建立的小型豬骨加工工藝可有效處理和抑制異種蛋白對人淋巴細胞增殖的刺激和誘導作用，表明小型豬混合骨與皮質骨其異種蛋白的抗原性存在一定的差異；本小型豬骨加工工藝和免疫原性的檢測和分析系統的建立為醫用性異種骨的使用提供了理論與實驗數據的參考。

小型豬；異種蛋白；抗原；CCK-8；酶聯免疫吸附

近年來，小型豬作為醫用材料特別是異種移植的供體具有許多優點，由于豬在心血管系統、消化系統、皮膚系統、骨骼發育、營養代謝等方面與人類具有較大的相似性，既能解決人源器官嚴重不足、提供源源不斷的供體器官、組織、細胞，也可克服靈長類動物異種帶來的倫理、烈性病毒傳染病等問題，一直是人類異種移植的首選供體和研究開發的熱點。其中，豬骨的研究作為人類骨的移植和替代更是迅猛發展[1-2]。本研究組多年來一直從事豬骨的生物學材料、力學、免疫學和病毒學的研究。特別是建立和建全了一套研制豬骨醫用材料的生產和制備工藝；并且從生物力學、微生物與免疫學諸方面對生產和制備的豬骨材料進行了系統的檢測與分析[3-5]；本文報告的是應用CCK-8和ELISA實驗方法對本加工工藝制備的混合骨與皮質骨的免疫原性的差異性進行了初步的檢測與分析。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

1.1.1 主要試劑制備工藝中原料除豬骨外無任何其它添加物，化學處理試劑為無水乙醇和乙醚兩種，處理后均經過晾干揮發。

1.1.2 骨粉樣本標識號混合骨粉：①-7,8,9：X111001/H-粉（處理前）、③-1,2,3：X111001/H-F（處理后）；皮質骨粉：②-10.11：X111001/P-粉（處理前）、④-4,5：X111001/YA-01（處理后）。

1.1.3 材料進口RPMI1640，0.22u過濾器，細胞培養液（含FCS），PHA，人骨粉浸出液，豬骨粉浸出液，蛋白定量試劑盒、3H-TdR，CCK-8Kit（日本），抗CD3-PreCP、CD4-FITC、CD8-PE熒光抗體標記物，抗CD16/56PE-CD3FITC熒光抗體標記物，96孔進口培養扳，淋巴細胞分離液等。

1.2 實驗方法

1.2.1 小型豬骨的來源與獲取小型豬骨選自上海浦東新區南匯老港鎮華新特種養殖場[上海小型豬繁育與實驗研究基地，許可證號SCXK（滬）2007-2013]提供的巴馬小型豬，豬耳號01733575，雄性5月半，體重26kg。將小型豬在消毒治療室中經麻醉處死后由專業取骨人員將除顱骨和趾骨外的其它骨骼剔取，置入消毒袋中，用低溫轉運箱運回公司冷藏。

1.2.2 小型豬骨生產工藝小型豬骨原料經-70℃以下深低溫冷藏不少于2個月后出庫經下列過程制備：于30萬級凈度車間中經常溫純水復溫后，切除軟組織和軟骨；并按需要切割成形（骨塊、骨條、骨粒）；置于沖洗器中用純化水于高壓下沖洗至外觀白色或微黃，表面無血絲及其它附著物；經傳遞窗移入10萬級凈度車間中用純化水漂洗數次至漂洗液清澈；用脫水乙醇和乙醚進行化學處理；晾干后經凍干機冷凍干燥48h后部分用粉碎機加工成顆粒狀粉末供實驗用；其余按上述規格用真空包裝機按需進行三層包裝；最后經輻照進行滅菌及病毒滅活處理。

1.2.3 小型豬骨粉異種蛋白浸出液制備稱量待檢無菌包裝的小型豬骨粉樣本，用無菌RPMI-1640定量浸泡4℃ 24h、48h、72h多個時間點以獲得最佳浸泡時間（攪拌中），高速離心獲取上清，經0.22u進口過濾器過濾分裝和蛋白測定（分別用紫外或試劑盒測定上清液中蛋白含量）備用。

1.2.4 浸出液蛋白含量的蛋白定量試劑盒檢測[6]蛋白質濃度測定（BCA法）BCA Kit：BD公司；每個樣品取6μl＋水54μl，分2個復孔，每孔30μl，加入96孔板。按照96孔板每孔加試劑盒中A、B混合液240μl，其中A：B混合液配制體積＝50：1，37℃孵育30min后，在酶標儀上測濃度，按照標準曲線的濃度，計算檢測樣本蛋白含量。

1.2.5 CCK-8實驗對浸出液蛋白誘導淋巴細胞增殖分析采用Dojindo公司的CCK-8試劑盒，取新鮮分離的PBMC，用10%FBS RPMI-1640培養液，計數調整細胞濃度為2×106/ml，加入96孔板，每孔2×105，然后再分別加入不同濃度骨蛋白浸出液，終體積200μl，每組的細胞接種5個復孔，置37℃，5% CO2培養箱中培養72h，取出100μl上清待檢測細胞因子，余下的細胞內每孔補加培養液100μl。再每孔加入10μl的CCK-8溶液，混勻（加樣時注意避免在孔中生成氣泡而影響OD值的讀數）。將96孔板在培養箱內孵育3h，用酶標儀測定450nm的OD值。

1.2.6 FACS對浸出液蛋白誘導淋巴細胞亞群表型分析[7]收集培養前后的細胞（106），RPMI 1640洗滌一次，棄去上清；用1ml RPMI-1640培養液重懸細胞，37℃、5% CO2環境中培養1h；PBS（含1% FBS）洗滌細胞，再用PBS（含1% FBS）洗滌兩次，1%多聚甲醛固定，在流式細胞儀（BD FACS Calibur）檢測。結果使用BD CELLQUEST軟進行分析。

1.2.7 雙夾心ELISA檢測[8]浸出液蛋白誘導淋巴細胞培養上清中細胞因子首先加抗體（Ab-1）包被4℃過夜，洗滌3次、拋干，加待檢細胞因子（Ag）37℃ 60min，洗滌3次、拋干，加用非同種動物生產的特異性抗體（Ab-2）37℃ 60min，洗滌3次、拋干，加入酶標抗Ab-2抗體（AB-3）37℃ 60min，洗滌3次、拋干，加底物液37℃ 20min，加終止液，用ELISA檢測儀測定OD值。

1.3 統計學分析數值以均值±標準差（Mean± SD）來表示，使用Prism（GraphPad）軟件進行統計分析。兩組之間的差異作Student’s t檢驗，在進行雙側的配對或非配對Student’s t檢驗之前，以One-way ANOVA進行方差齊性分析。將P＜0.05視為有統計學差異并在圖中進行標注（*,0.01＜P＜0.05；**,0.001＜P＜0.01；***,P＜0.001）。

2 結果

2.1 浸出液蛋白含量的UV和蛋白定量試劑盒檢測見表1。

表1 待檢樣本分組與浸出液蛋白含量的檢測(μg/ml)

2.2 CCK-8實驗對浸出液蛋白誘導淋巴細胞增殖分析見表2。

表2 浸出液蛋白誘導人外周血淋巴細胞增值的(CCK-8)分析

由表2定量浸出液蛋白誘導人外周血淋巴細胞增值（72h，37℃，CO2）的（CCK-8）實驗分析結果提示：顯然處理前皮質骨和混合骨浸出液異種蛋白對人淋巴細胞的刺激指數較處理后皮質骨和混合骨浸出液異種蛋白對人淋巴細胞的刺激指數具有一定的差異，表明本小型豬骨生產工藝具有降低浸出液異種蛋白對人淋巴細胞刺激誘導作用（③④與①②比較）。

2.3 FACS對浸出液蛋白誘導淋巴細胞亞群表型分析圖1的流式細胞儀檢測了經處理前后的小型豬骨浸出液蛋白（72h，37℃，CO2）刺激后的T淋巴細胞亞群（CD3、CDR4和CD8）表型未見明顯差異，其百分比含量呈正常比例分布。

圖1 經浸出液蛋白刺激后的淋巴細胞亞群表型

2.4 雙夾心ELISA檢測浸出液蛋白誘導細胞培養上清細胞因子圖2（A、B、C、D）為處理前、后的小型豬骨浸出液蛋白（72h，37℃，CO2）刺激人淋巴細胞增殖上清中細胞因子ELISA檢測的分析結果。IL-10表達均低于處理前組。D經處理后皮質組和混合骨的細胞培養上清中TNFa表達均低于處理前組

圖2 處理前后小型豬骨浸出液蛋白刺激人淋巴細胞增殖上清中細胞因子ELISA檢測

3 討論

同種異體組織和器官移植的供體來源有限，使異種移植再度成為研究熱點。豬被認為是理想的供體之一[9]。異種移植的主要障礙為組織相容性的科學問題。越來越多的研究證明：某種異種蛋白（異種抗原）包括移植物中未被處理完全的異種動物細胞、血清成分、細胞因子和炎癥因子以及多種靶抗原分子可被人血清中天然存在的抗體結合、激活補體導致超急排斥反應的發生，也可出現在移植物在受體中持續刺激和誘導宿主的免疫系統的T、B細胞和相關免疫活性細胞產生免疫應答而導致急性和慢性排除反應的發生[10-11]。

本小組先前已研究發現小型豬的SLA（MHC）A、B位點與人的HLA存在較大的差異，且不同種系小型豬也有一定的差異和突變體，因此異種移植，特別是小型豬的器官移植首要問題是清晰其的遺傳背景，將來有望人們能用基因工程手段改造和解決這一障礙。現已有報道，豬的主要靶抗原為α-Gal，它的表達受α-1,3半乳糖基轉移酶（α-GT）的控制[12]，還有一些抗原可與人血清抗體結合，如TNF誘導PAEC表達的gp65和gp100，豬組織表達的人血型抗原A等[13]。Minanov等[10]研究還發現異種移植后移植物中存在單個核細胞浸潤，這些單個核細胞可能為NK細胞，T細胞和B細胞。這些免疫活性細胞在異種移植的免疫學研究中一直是人們關注的重要科學問題。

本研究小組一直致力于異種骨生產和臨床應用的研究，從2008年開始著手對豬骨進行研究，當時向市場采購了部份豬骨生產樣品后進行了免疫學檢測，結果顯示免疫原性符合用于人體的要求。為了能夠滿足產品的全面追溯要求，經研究組及骨科權威專家研討后選擇了特種小型豬。并委托農學院專家指定的養殖場養殖了一批豬種，目前已從部分小型豬切取骨原投入試生產并送至相關單位進行性能檢測。現已具備了符合無菌醫療器械生產條件要求的生產廠房、倉庫和產品檢測實驗室、檢測儀器和植入性醫療器械生產必需的人力資源。建立和建全了異種骨研究平臺，包括異種骨制備、生產后樣品的力學、病毒學檢測以及免疫學等多方面的分析和檢測。本文研究表明，應用免疫學手段和方法可以獲得較為穩定的小型豬骨的浸出性異種蛋白，其中包含了多種異種蛋白質抗原，同時提示本標準生產流程可顯著祛除小型豬骨中的異種蛋白（CCK-8實驗表明經處理后的小型豬骨浸出液中異種蛋白刺激淋巴細胞增殖反應具有一定的差異，且皮質骨較混合骨具有較強的誘導淋巴細胞增殖反應的能力）；圖1的流式細胞術結果提示經處理的小型豬骨中的異種蛋白刺激誘導的人淋巴細胞形態和亞群比例未見明顯差異，表明經處理后的小型豬骨對人淋巴細胞無毒副作用。

實驗還提示，經處理前、后的小型豬骨中的異種蛋白刺激誘導的人淋巴細胞增殖上清液中的四種炎癥因子（TNF-a、IL-1、IL-10和IFN-r）表明具有顯著的統計學差異，進一步提示本標準生產流程可顯著降低小型豬骨中的異種蛋白對淋巴細胞增殖上清中炎癥因子的表達和含量，這些炎癥因子可能與異種骨的移植的慢性排斥存在一定的關聯性，值得關注。進一步完善和提高對小型豬骨的加工處理，特別是對皮質骨和混合骨的結構和力學以及免疫學的分析研究有助于提高本小型豬骨的生產工藝的優化和臨床應用。

本文提示，應用已建立的小型豬骨加工工藝可有效處理和抑制異種蛋白對人淋巴細胞增殖的刺激和誘導作用，且表明小型豬混合骨與皮質骨其異種蛋白的抗原性存在一定的差異；本小型豬骨加工工藝和免疫原性的檢測和分析系統的建立為醫用性異種骨的臨床應用提供了理論與實驗數據的參考。

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The Machining Process of Medical Minipig-bone and the Detection and Analysis of Immunogenicity

Zhou Xiaoyao Gu Xiangfeng Liu Boan Kong Fanping Zhao Rong Zhang Jiying Yu Qiwen Zhang Dongqing

ObjectiveTo prepare the heterogeneous protein of medical minipig-bone, and detect and analyze the lymphocyte proliferation responses stimulated and inducted by the heterologous protein of cortical and cancellous mixed bone(hereinafter referred to as mixed bone)and cortical bone alone (hereinafter referred to as cortical bone).MethodsMedical minipig mixed bone and cortical bone meal were prepared by chemical and physical methods, stirred them with quantitative RPMI-1640 and soaked for 72 hours in 4℃, then supernatant was obtained by high-speed centrifugation followed by protein quantitative detection. Immediately the lymphocyte proliferation responses of human peripheral blood stimulated and induced by mixed and cortical bone heterogeneous protein were detected by CCK-8 kit, as well as the four kinds of cytokine expression in cultured serum.ResultsCCK-8 results showed that:the lymphocyte proliferation responses stimulated and induced by mixed bone and cortical bone had no statistical difference. Whereas ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) for IFN-r, IL-1, IL-10 and TNF-a in human lymphocyte culture supernatant results showed that:compared with the control group, these four inflammation-related factors of minipig-bone treated group showed statistically significant difference after treatment(P＜0.05); meanwhile compared with mixed bone group, the expression of inflammation-related factors of cortical bone group also had significant difference.ConclusionThe results suggest that the application minipig-bone machining process which has been established can effectively handle and inhibit the role of heterologous proteins in stimulating and inducing lymphocyte proliferation response, and the heterogeneous protein antigenicity of minipig mixed bone and cortical bone have some differences. The establishment of the minipig-bone machining process and immunogenicitydetection and analysis system can be a reference of theoretical and experimental data for the use of medical xenograft bone.

Minipig; Heterogeneous protein; Antigen; CCK-8; ELISA

R392

A

1673-5846(2013)06-0135-05

1上海亞朋生物技術有限公司，上海 201203

2上海市免疫學研究所，上海 200025

國家自然基金（No.31270963），上海市科委重點（No.10JC1408500，No.10ZR1426100）項目資助