HPLC法同時測定清熱通淋片中苦參堿和氧化苦參堿的含量

孫海濤

HPLC法同時測定清熱通淋片中苦參堿和氧化苦參堿的含量

孫海濤

目的采用反相高效液相色譜法同時測定清熱通淋片中苦參堿和氧化苦參堿的含量。方法使用Capcell C18 色譜柱（4.6mm×250mm，5μm），流動相為甲醇-磷酸鹽緩沖液（PH3.0）（7：93）（磷酸鹽緩沖液配制：準確量取磷酸二氫鉀3.402g溶解于1000mL水中，用磷酸調PH值至3.0），流速為0.8mL?min-1，檢測波長220nm，柱溫為40℃。結果苦參堿和氧化苦參堿進樣量在0.3118～4.6770μg和0.02976～0.44640μg范圍內，線性關系良好；平均回收率（n=6）分別為97.1 %和98.4%，RSD分別為0.24%和1.48%。結論本法簡便、準確，重復性好，可為清熱通淋片的質量控制提供實驗依據。

清熱通淋片；苦參堿，氧化苦參堿；高效液相色譜法

清熱通淋片主要成分是中藥制劑，分別為苦參、爵床、硼砂、白茅根四種中藥，或是含有提取物復方制劑，具有的臨床作用是解熱、利尿、通淋。較常用于下焦濕熱所致熱淋。癥見：小便頻急、尿道刺痛、尿液混濁、口干苦等，以及急性下尿路泌尿系統感染見于上述癥狀者。苦參中含有苦參堿、氧化苦參堿等生物堿類成分，具有清熱燥濕、殺蟲、利尿的作用[1]?？鄥⒅猩飰A含量測定方法包括比色法，薄層色譜掃描法和高效液相色譜法等[2]。近些年發表的應用高效液相色譜法的文章比較小，同時較多的文獻應用C18色譜柱進行檢測苦參堿含量等主要成分[3]或是應用氨基色譜柱同時檢測氧化苦參堿含量和苦參堿含量，罕見應用C18色譜柱時進行氧化苦參堿及苦參堿文獻的報道。本文中所參考的文獻操作方法的流動相，選取用同時進行優化色譜，創建應用反相高效液相色譜法，應用C18色譜柱時進行氧化苦參堿的含量檢測和復方制劑中苦參堿含量的檢測。本方法操作簡便，精密度好，結果準確可靠。

1 儀器與試藥

島津LC-2010高效液相色譜儀（包括四元泵、自動進樣儀、真空脫氣儀、柱溫箱、Class VP色譜工作站、紫外檢測儀），AE-160型電子分析天平，AG-135型電子分析天平，KQ-500E超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。對照品為氧化苦參堿（生產批號批號110780- 200506）和苦參堿（產品批號為110805-200306）在中國藥品生物制品檢定所采購；甲醇、磷酸均為色譜純。采用其它試劑為分析純，應用的水為超純水。清熱通淋片（規格：片芯重0.39g，江西杏林白馬藥業有限公司）。

2 方法及結果

2.1 對照品溶液配制方法準確量取15mg苦參堿作為對照品、準確量取8mg氧化苦參堿作為對照品，放置在10mL量杯內，加入適量的甲醇溶解同時稀釋到預定刻數，攪拌均勻，準確稱取5mL混合后對照品溶液，放置在25mL量杯內，用磷酸鹽緩沖液（PH3.0）稀釋至預定刻度攪拌均勻即可。

2.2 供試品溶液配制方法在進行供試品溶液配制時應去除包衣，準確稱量研磨成細粉末，準確量取1.0g，放置在帶有瓶塞的圓錐瓶中，準確量取50mL三氯甲烷加入，量取1mL濃氨試液加入置具塞錐形瓶中，密閉瓶塞充分攪拌均勻并且靜止24小時以上，超聲處理（功率500W，頻率40kHz）30分鐘，冷卻再次進行稱重，同時應用三氯甲烷充填補足缺少的劑量充分攪拌均勻，進行濾過。精密量取續濾液25mL，回收溶劑至干，立即取下，殘渣加甲醇1mL使溶解，轉移至l0mL量瓶中，加磷酸鹽緩沖液（PH3.0）稀釋至預計刻度，充分攪拌均勻同時進行過濾，即可獲得所需溶液。

2.3 陰性樣品溶液配制方法準確量取苦參的陰性樣品，同“2.2”項下方法操作，配制獲得陰性樣品溶液。

圖1 HPLC色譜圖

2.4 線性相關性分析精密量取對照品含量溶液劑量分別為1μL、3μL、5μL、10μL、15μL，依次注入相色譜儀內，同時進行峰面積的檢測，同時橫坐標為進樣量（μg），縱坐標為峰面積值，并且進行標準曲線的繪制，苦參堿及氧化苦參堿的回歸方程計算為Y＝1039908.67X+3976.03，r＝1.0000；Y＝1028954.62X-1574.89，r＝1.0000，實踐結果顯示：苦參堿進樣量在0.3118μg～4.6770μg，氧化苦參堿進樣量在0.02976μg～0.44640μg之間，同峰面積存在較好的線性相關。

2.5 精密度試驗過程精確量取同種供試品的溶液，依據以上條件，反復進行6次檢測，檢測峰面積。結果顯示苦參堿和氧化苦參堿峰面積的RSD（n=6）分別為0.84%，2.97%。試驗結果證實精密度相對較好。

2.6 穩定性的試驗過程精確量取同種供試品溶液，依據以上條件分別在0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h進行精密檢測，同時對氧化苦參堿和苦參堿和峰面積的 RSD（n=7）分別為1.21%和1.47%。因此結果表明12小時內的供試品溶液情況較為穩定。

2.7 重復性試驗方法準確稱取清熱通淋片（批號20121101）2g，共6份，依據“2.2”項配制方法量取供試品溶液，依據以上條件進行檢驗。實踐結果顯示苦參堿和氧化苦參堿的含量相加和的平均值為（n=6）分別為1.1mg?mL-1，RSD分別為0.48%，表明此方法重復性較好。

2.8 回收率試驗方法準確稱取適量的清熱通淋片（批號：20121101）粉末6份，每份0.5g，每份分別精密加入含苦參堿1.347mg·mL-1和氧化苦參堿0.194mg?mL-1的加入1mL對照品的甲醇溶液，依據“2.2” 項配制方法量取試驗需要溶液，依據以上條件進行檢驗分析檢測，計算和回收。

2.9 樣品測定率結果苦參堿和氧化苦參堿的平均回收率（n=6）分別為97.1%和98.4%，RSD分別為0.24%和1.48%。

分別取不同批次的清熱通淋片，依據“2.2” 項配制方法量取供試品溶液。精密量取5μL供試品溶液，依據以上條件進行檢驗分析檢測，同時進行峰面積的測定，同時應用外標方法進行計算氧化苦參堿和苦參堿精確含量，實踐結果分析顯示3批樣品含量為苦參堿和氧化苦參堿之和分別為1.14、1.13、2.37mg?mL-1。

3 討論

3.1 檢測波長的選擇

3.2 供試品制備方法的選擇分別對采用光譜掃描針對氧化苦參堿和苦參堿進行檢測，根據試驗掃描結果顯示，同時依據2010年版中國藥典中的苦參藥材含量檢測波長[1]，故制定測定波長為220nm。

選用樣品為濃氨試液-氯仿超聲、鹽酸-甲醇超聲、濃氨試液-甲醇超聲。實踐結果證明，鹽酸-甲醇超聲掃描含有較多的雜質，不能正常進行分析；所以采用濃氨試液-甲醇超聲提取的結果顯示含量最高，但掃描含有較多的雜質，不能達到和接近標準基線分離；應用濃氨試液-氯仿超聲掃描檢測，可相對較高提取含量，同時在進行掃描檢測時存在較少雜質，相對較好的樣品分離度，因此采用濃氨試液-氯仿為標準的提取溶劑。

3.3 色譜柱的考察中國藥典2010版一部中藥材“苦參”含量測定項下采用氨基鍵合硅膠為填充劑的色譜柱同時測定苦參堿和氧化苦參堿[1]，氨基鍵合硅膠柱較少應用，推廣起來受一定限制，并且試驗結果表明，使用氨基鍵合硅膠柱出峰較快，難于分離成分復雜樣品。故本文建立了一種全新的采用普通C18柱同時測定處方中苦參堿和氧化苦參堿的方法。

3.4 分離條件的選擇采用C18色譜柱比較不同的流動相：乙腈-0.1%磷酸溶液（三乙胺調PH值至8.0）、乙腈-磷酸鹽緩沖液（PH6.8）-三乙胺、甲醇-磷酸鹽緩沖液（PH3.0）。結果表明，以甲醇-磷酸鹽緩沖液（PH3.0）平衡時間短，分離效果佳，該流動相可使苦參堿和氧化苦參堿均能達到基線分離。

3.5 選擇進樣量的方法因供試品溶液的流動相和極性的極性存在比較大差異性，過大的進樣量會導致峰型較差，發生分裂及峰變寬，過小的進樣量會導引起不準確的進樣，因此5μL為標準的進樣量定最為合適。

3.6 小結本方法可以采用普通C18色譜柱準確、靈敏的同時測定清熱通淋片中苦參堿和氧化苦參堿這兩種生物堿的含量，苦參堿和氧化苦參堿均能達到基線分離，重復性及回收率較好，結果可靠，為清熱通淋片的質量標準的建立提供了依據。

[1] 中華人民共和國衛生部.中國藥典2010年版一部[S].北京：人民衛生出版社,2010：188.

[2] 蔣珍藕.苦參堿的提取工藝及測定方法的研究進展[J].中醫藥導報,2005,11(08)：90.

[3] 中華人民共和國衛生部.中國藥典2005年版一部[S].北京：人民衛生出版社,2005：497.

R917

A

1673-5846(2013)06-0202-04

吉林省食品藥品檢驗所，吉林長春 130033