VEGF CD44v6MMP－9在子宮內膜異位癥組織中的表達及臨床意義

姚紅梅 郭 靜 石秀玲

（濟寧醫學院附屬醫院，山東 濟寧272029）

子 宮 內膜異位 癥（endometriosis、EMS）是1885年由VonreckLinghausen［1］首次提出并命名，是一種常見的婦科良性病變，但具有類似于惡性腫瘤的組織侵襲、血管生成等生物學行為，復發率高。以卵巢子宮內膜異位癥最多見。其發病率約為6%～8%，在不孕、痛經等患者中，其發病率有所增加，約為30%～45%。近年來EMS有上升的趨勢，嚴重影響了婦女的日常生活。關于EMS發病機制的研究被廣泛關注，為阻斷EMS的發生、發展提供新的有效的治療靶點。本研究通過檢測子宮內膜異位癥組織中VEGF、CD44v6及MMP－9的表達，從而探討其在EMS發病機制中可能的作用及相關性。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取濟寧醫學院附屬醫院2009年3月至2010年10月因卵巢囊腫行腹腔鏡或開腹手術的患者，術后經病理證實為卵巢子宮內膜異位癥60例作為研究組。在位內膜為卵巢子宮內膜異位癥患者同時診刮或切除子宮所得的內膜52例。選擇同期在本院因子宮平滑肌瘤行子宮全切，且經病理證實無子宮內膜疾病及異位癥患者的子宮內膜標本44例為對照組。所有患者年齡均35～46歲，均為增殖期子宮內膜，月經周期規律，術前3個月未應用激素治療。各組間的年齡差別無統計學意義。

1.2 主要試劑

兔抗人VEGF、鼠抗人CD44v6及鼠抗人MMP－9單克隆抗體均購自福州邁新生物技術開發有限公司；鏈霉素抗生物素蛋白－過氧化物酶（SP）免疫組化試劑盒、DAB染色試劑等，購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3 方法

將蠟塊標本進行5μm厚連續切片4張，1張用于HE染色復查，確定診斷。余者切片常規二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化。采用SP法行CD44v6、VEGF和MMP－9檢測。實驗操作嚴格按說明書進行。以0.01mol／L PBS代替一抗作為陰性對照，以已知陽性標本為陽性對照。

結果判定：陽性均為棕黃色顆粒，分布于細胞膜和／或胞漿。具體如下：著色強度：不顯色或顯色不清為0；淺黃色為1；棕黃色為2；深褐色為3。陽性細胞百分率：陽性細胞百分數＜5%，0分；5%～35%，1分；36%～65%，2分；＞66%，3分。兩項得分相加，0～1分為（－），2～3分為（＋），4分及以上為（?）。

1.4 統計學方法

應用SSPS 13.0統計軟件進行統計學分析，采用秩和檢驗，檢驗水準均為0.05，兩分類變量的關聯性分析。

2 結果

2.1 VEGF的表達

VEGF主要表達于子宮內膜腺上皮細胞的胞漿，灶性分布，在子宮內膜間質細胞、血管內皮細胞也有表達，但在上皮細胞的表達最強。陽性細胞胞漿呈棕黃色或棕褐色。3種子宮內膜中VEGF表達的分布差別有統計學意義。見表1。進一步兩兩比較，卵巢異位內膜VEGF的陽性表達明顯高于在位內膜（Z＝－5.725，P＝0.000）與正常內膜（Z＝－3.498，P＝0.000），差異均有統計學意義；在內異癥在位內膜中的陽性表達高于正常子宮內膜，差異有統計學意義（Z＝－2.674，P＝0.000）。

表1 3種子宮內膜中VEGF表達的等級比較

2.2 CD44v6的表達

CD44v6主要表達于子宮內膜腺上皮細胞、腔面上皮細胞。主要是細胞膜陽性，染成棕黃色。胞漿可有少量表達，但著色比胞膜淺，意義不明確。3種子宮內膜中CD44v6表達的分布差別有統計學意義。見表2。進一步兩兩比較，卵巢異位內膜CD44v6陽性表達高于在位內膜（Z＝－5.610，P＝0.000）與正常內膜（Z＝－5.596，P＝0.000），差異有統計學意義；內異癥在位內膜與正常子宮內膜相比，陽性表達率較高，但差異無統計學意義（Z＝－0.388，P＝0.698）。

表2 3種子宮內膜中CD44v6表達的等級比較

2.3 MMP－9的表達

MMP－9主要表達于子宮內膜腺上皮細胞及間質細胞胞漿內，陽性細胞的胞漿被染成棕黃色或棕褐色。3種子宮內膜中MMP－9表達的分布差別有統計學意義。見表3。進一步兩兩比較，卵巢異位內膜MMP－9陽性表達明顯高于在位內膜（Z＝－4.957，P＝0.000）與正常內膜（Z＝－5.179，P＝0.000），差異均有統計學意義；在內異癥在位內膜中的陽性表達略高于正常子宮內膜，但無統計學意義（Z＝－0.388，P＝0.698）。

表3 3種子宮內膜中MMP－9的表達等級比較

2.4 VEGF、CD44v6和MMP－9在異位內膜組織中表達的相關性

采用兩分類變量的關聯性分析，異位內膜組VEGF和CD44v6呈正相關（r1＝0.462，χ2＝42.038，P＝0.000）；MMP－9與CD44v6之間呈正相關（r2＝0.558，χ2＝70.534，P＝0.000）；MMP－9與VEGF呈正相關（r3＝0.397，χ2＝29.187，P＝0.000）。

3 討論

子宮內膜異位癥（EMS）的發病機制不明，眾說紛紜，目前仍以經血逆流種植學說為主導理論。然而有經血逆流的婦女中只有10%～15%的人發生EMS。有些國內學者提出“在位內膜決定論”。即內膜細胞在異位處生長、發育、出血并引起臨床癥狀。CD44v6、MMP－9與VEGF直接影響著異位的子宮內膜的黏附、侵襲和局部血管形成等生物學特性。

3.1 VEGF與EMS的關系

血管內皮生長因子（VEGF）是血小板衍生生長因子超家族的成員，分子量為34～36KDa，是一種多肽類生長因子。VEGF蛋白主要灶性表達于腺上皮細胞的胞漿。Takehara等［2］研究發現，EMS患者的子宮內膜中VEGF－A mRNA和VEGF－C mRNA表達比非EMS患者明顯增高。近期的研究發現EMS患者中VEGF基因型和表達頻率與正常人存在明顯的差異［3］。

本文結果顯示：免疫組化顯示VEGF陽性細胞胞漿著色，被染成棕黃色。本研究中VEGF在卵巢異位內膜中的表達均顯著高于在位內膜和正常子宮內膜，表明在異位內膜中VEGF含量高，與異位內膜種植中血管的形成及增生有一定關系。VEGF是一種多肽類生長因子，主要參與調控血管生成。其表達高低反映了該組織的血管生成的活性。異位內膜病灶內血管的數量及面積明顯高于在位內膜。它直接作用于內皮細胞，通過和血管內皮細胞的特異性受體結合，促進內皮增殖和血管生長。同時，能增加血管通透性，促進包括纖維蛋白原在內的血漿蛋白的滲出［4］，因而間質高度血管化，進一步促進異位內膜的種植和增殖。Fujii等［5］發現子宮內膜異位癥患者血清中VEGF含量增加，VEGF的含量增高，能維持內膜異位部位的血管呈現較高的活性，刺激毛細血管增生，促進異位腺上皮細胞生長的同時促進異位內膜在該部位進一步增殖和浸潤至盆腔和腹膜內組織，增大病灶的深度及范圍，形成腹腔的異位灶，從而加重痛經的程度。Nap等［9］研究發現，抗人類VEGF抗體（HUMV833）可明顯減少EMs鼠模型體內異位灶微血管密度，并能抑制內膜種植和生長。與本文結果一致，更有力的證實了VEGF在EMS的異位內膜在異位部位血管形成及種植過程中的重要性。

3.2 CD44v6與EMS的關系

CD44v6是細胞黏附分子中的一類，是CD44的一種異構體。是一類介導細胞與細胞、細胞與細胞外基質（ECM）黏附作用的膜表面糖蛋白，在上皮源性細胞和腫瘤中表達。CD44v6是透明質酸的主要受體和淋巴細胞歸巢受體，能改變腫瘤細胞表面黏附分子的構成及功能，介導細胞與基質的粘連，參與細胞偽足的形成及腫瘤的發生、發展和轉移。EMS具有惡性腫瘤侵襲性生長的惡性生物學行為，因而CD44v6在EMS發病機制中的作用不容忽視。

本文結果顯示：CD44v6陽性腺上皮及腔面上皮細胞胞膜著色，被染成棕黃色，少量細胞胞漿內著色，比胞膜染色淺，間質細胞未見著色。有實驗表明，CD44v6參與了子宮內膜細胞與腹膜表面間皮細胞黏附，淋巴細胞歸巢受體的功能，能幫助子宮內膜細胞逃避腹腔液免疫細胞（NK細胞）的識別和殺傷，繼而得以存活。CD44v6透明質酸受體的作用，可以幫助內膜細胞與腹膜間皮細胞的透明質酸配體黏附，異位的內膜細胞更易侵襲種植。本研究認為CD44v6在異位癥發生中促進了異位的內膜細胞與周圍組織黏附。

3.3 MMP－9與EMS的關系

MMP－9是MMPs家族中分子量最大的明膠酶，又稱明膠酶B，分子量92kD，可降解Ⅳ型、Ⅴ型膠原及彈性蛋白等ECM的主要成分，參與細胞外基質降解和新血管形成，在許多惡性腫瘤組織中均可檢測到MMP－9活性形式的表達。在子宮內膜異位病灶周圍，有著連續、完整的基底膜，Ⅳ型膠原是其固有成分之一［10］。有實驗表明，MMPs在正常情況下，表達量很少，而且以無活性的酶原形式存在，而在炎性細胞因子、激素、生長因子刺激下其表達量上升及活性增加，如胚胎發育、血管新生、子宮復舊、組織修復與重塑、炎癥反應以及腫瘤的侵襲與轉移等情況。Szamatowicz的研究結果證實［7］，MMP－9可通過和整合素的相互活化而加強細胞間的黏附作用，同時促進血管內皮細胞的出芽，導致新生血管的形成，從而在子宮內膜細胞的異位黏附、種植和生長的過程中發揮重要作用。

本文結果表明：MMP－9在異位內膜組陽性表達率最高，其次為在位內膜組和正常內膜組，與邱曉紅等［11］研究結果一致。MMP－9的高表達表明異位內膜細胞對ECM有著最強的降解能力，利于異位內膜的侵襲性種植和生長，進而破壞周圍組織，使病變擴散，逐漸加重。提示EMS患者異位內膜細胞的生物熱性與在位內膜細胞有差別，前者更具侵襲能力，因而能異位種植，這與沈蓉等［8］研究結果一致。目前有異位內膜孕激素受體顯著低于正常子宮內膜的報道［12］，因子宮內異癥、子宮腺肌病患者在位內膜與異位內膜中，增殖期與分泌期的表達強度無明顯差異，失去了周期性變化規律。MMP－9的蛋白水解活性破壞局部組織結構及基底膜成分，有利于腹腔的侵襲，同時在MMP－9促細胞間黏附和促血管形成的共同作用下，促使逆流入腹腔的內膜組織種植生長并使病灶不斷擴大。

3.4 VEGF CD44v6及MMP－9在子宮內膜異位癥發生中的協同作用

EMS的發生、發展是一個多步驟多階段而且多個細胞因子相互作用的復雜過程。VEGF、CD44v6及MMP－9在EMS發生發展過程中，有各自獨特的作用，同時又緊密關聯，相互促進。異位的子宮內膜細胞必須具備黏附、侵襲及血管生成3個基本環節，才能在種植部位像腫瘤細胞一樣生長。首先是異位內膜細胞在CD44v6作用下黏附在種植部位，其次MMP－9發揮降解基底膜糖蛋白及細胞外基質成分的作用，增強了異位內膜細胞的侵襲能力，再則VEGF促進異位部位的血管重建和增生，血管通透性增加，新的纖維及血管化間質建立，最終EMS得以發生和發展。在這個過程中，CD44v6為MMP－9定位于細胞表面提供了受體，同時可以通過與MMP－9結合而激活腫瘤壞死因子－β（TGFβ），導致新生的血管生成［13］。血管生成過程中的內皮細胞循環及血管結構形成均需要MMP－9對ECM的降解和重建，協同促進了EMs的發生發展。隨著新藥如MMPs抑制劑和VEGF抑制劑的問世以及在惡性腫瘤中的應用，為EMS的治療提供了新的研究方向。

［1］ O Down MJ，Philipp EE.The history of obstetrics and gynecology［M］.New York：The Part henon Publishing Group，2000：523－525.

［2］ Takehara M，Veda M，Yamashita Y，et al.Vascular endothelial growth factor A and C gene expression in endometriosis［J］.Humpathol，2004，35（11）：1369－1375.

［3］ Kim SH，Choi YM，Choung SH，et al.Vascular endothelial growth factor gene＋405C／G polymorphism advanced stage endometriosis［J］.Hum Reprod，2005，20（10）：2904－2908.

［4］ Pepper MS，Ferrara N，Orci L，et al.Potent synergism between vascular endothelial grower factor and basic fibroblast growth factor in the induction of angiogenesis in vitro［J］.Biochen Biophys Res Commun，1992，189（2）：824－831.

［5］ Fujii EY，Nakayama M，Nakagawa A.Concentrations of receptor for advanced glycation end products，VEGF and CML in plasma.follicular fluid，and peritoneal fluid in women with and without endometriosis［J］.Reprod Sci，2008，15（10）：1066－1074.

［6］ 辛曉燕，李潔，嚴瑞蘭，等.血管生成因子在子宮內膜異位癥中的作用［J］.現代婦產科進展，2001，10（3）：187－189.

［7］ Szamatowicz J，Laudanskip，Tomaszewska I，et al.Matrixmetalloproteinase－9and tissue inhibitor of matrix metalloproteinase－1：apossible role in the pathogenesis of endometriosis［J］.Hum Reprod，2002，17（2）：284－288.

［8］ 沈蓉，田永杰.MMP－9、TIMP－1在子宮內膜異位癥患者子宮內膜中的表達及意義［J］.山東醫藥，2006，46（17）：20－22.

［9］ Nap AW，Griffion AW，Dunselmang A，et al.Anti－angiogenesistherapy for endometriosis［J］.J Clim Endocdol Metal，2004，89（3）：1089－1095.

［10］Evers JL，Willebrand D.The basement membrance in endometriosis［J］.Fertil Steril，1987，47（3）：505－507.

［11］邱曉紅，李荷蓮.基質金屬蛋白酶MMP－2MMP－9及其抑制因子TIMP－1TIMP－2在子宮內膜異位癥中的表達及意義［J］.中國實用婦科與產科雜志，2004，20（3）：158－160.

［12］Lu XE，Ning WX，Dong MY，et al.Vascular endothelial growth factor and matrix metalloproteinase－2expedite formation of endometriosis in the early stage ICR mouse model［J］.Fertil Steril，2006，8：1175－1181.

［13］Yu Q，Stamenkovic I.Cell surface－localized matrix metalloproteinase－9proteolytically activates TGF－βand promotes tumor invasion and angiogenesis［J］.Genes Dev，2000，14（2）：163－176.