針灸對阿爾茨海默病模型大鼠海馬神經元線粒體中親環蛋白D的影響

羅磊,杜艷軍,孫國杰

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針灸對阿爾茨海默病模型大鼠海馬神經元線粒體中親環蛋白D的影響

羅磊,杜艷軍,孫國杰

(湖北中醫藥大學,武漢 430065)

運用定量RT-PCR法觀察針灸對阿爾茨海默病(AD)模型大鼠海馬神經元線粒體中親環蛋白D(CypD)基因表達的影響,探討針灸防治AD的具體作用機制。運用大鼠海馬注射Ab1-42的模型復制方法,將大鼠隨機分為正常組、假手術組、模型組和針灸組,采用針刺加灸百會和腎俞穴的治療方法,通過定量RT-PCR法檢測AD模型大鼠海馬神經元線粒體中CypD mRNA的表達水平。大鼠行為學觀察可見針灸組大鼠進食飲水量正常,對外界刺激反應尚可,較模型組有所改善,同時通過對大鼠海馬神經元線粒體中CypD基因表達的擴增倍數統計學分析發現,模型組大鼠海馬神經元線粒體中CypD的表達明顯高于正常組和假手術組(＜0.01),而針灸組表達明顯低于模型組(＜0.05),提示針灸能夠有效抑制海馬神經元線粒體中CypD的過度表達,從而改善海馬神經元線粒體膜內外滲透失衡,減輕線粒體損傷。針灸防治AD可能與其抑制大鼠海馬神經元線粒體中CypD的過度表達,阻滯mPTP形成并改善線粒體的損傷有關。

針灸療法;阿爾茨海默病;大鼠;RT-PCR;CypD

阿爾茨海默病(Alzhemier’s disease,AD)是一種常見的神經系統退行性疾病,已成為繼心臟病、腫瘤、中風后的人類第四大殺手。臨床主要特征為進行性認知功能障礙及記憶力減退。b淀粉樣多肽(amyloid-bpeptide,Ab)在細胞內外沉積及線粒體異常改變均為AD的重要病理特征[1],其中線粒體損傷不僅是AD發病過程中的早起事件,且隨著AD病情的進展,神經元線粒體斷裂也隨之加重[2-3]。同時線粒體損傷機制不僅與其超微結構發生變化有關,電鏡下可見神經元胞質中線粒體數量明顯變少,結構不清,出現了明顯的腫脹,空泡樣變化,嵴斷裂,結構模糊;而且可能與線粒體能量代謝途徑、線粒體動力學異常途徑、線粒體通透性轉化孔(mPTP)開放途徑等密切相關。本課題通過定量RT-PCR(Quantitative RT-PCR,Q-RT-PCR)技術觀察針灸對線粒體通透性轉換孔mPTP的必需成分之一,即親環蛋白D(Cyclophilin D,CypD)的影響,以期揭示針灸防治AD的具體作用機制,為臨床治療提供可靠的依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

Wistar大鼠,SPF級、雄性、體重(200±20)g,20只,由湖北省實驗動物研究中心提供[許可證號SCXK(鄂)2008-0005]。實驗前所有大鼠置于鼠籠常規適應性喂養1星期;實驗時,參照文獻[4],經Morris水迷宮測試篩選,剔除不符合評定標準的大鼠后按編號表隨機分為正常組、模型組、假手術組和針灸組,每組5只,分籠飼養,并用苦味酸給予染色標記編號,整個實驗過程遵守動物倫理學規定。

1.2 主要試劑與儀器

AmyloidbProtein Fragment 1-42(美國sigma公司);大鼠腦立體定位儀(成都泰盟科技有限公司); Total RNA提取試劑(Invitrogen Life Technologies, 15596-026);定量PCR試劑盒(武漢谷歌生物科技有限公司);PCR儀(Hangzhou Bioer Teechnology Co,LTD); Morris水迷宮(MT-200Morris水迷宮視頻跟蹤系統,成都泰盟);熒光定量PCR儀(上海宏石醫療科技有限公司);高速冷凍離心機(Heal Force);美容艾條(f=0.6 cm,南陽漢醫艾絨有限公司)。

1.3 動物模型的復制

實驗用大鼠置于安靜清潔環境下,分籠喂養,溫度控制在(24±2)℃,定時給予充足清潔飲水和定量大鼠專用飼料。適應性喂養1星期后,無不良反應,飲食、飲水正常者,參照文獻[4],開始進行Morris水迷宮測試篩選,剔除不符合評定標準的大鼠。評定后的合格大鼠進行稱重,用10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉后,固定于手術臺上,使用大鼠腦立體定位儀固定頭部。無菌環境下,顱頂區備皮,剝開皮下筋膜暴露頂骨,進行手術區皮膚消毒,于兩側冠狀縫后鉆出小孔,取出碎骨屑,保持硬腦膜的完整。按照大鼠腦立體定位圖譜[5]選擇大鼠海馬區域用微量注射器緩慢將藥物Ab1-42(5mL)注入海馬(前囟后3.3 mm,中線左右各旁開1.5 mm,深度3 mm),5 min內注完,注射后留針5 min,按1.0 mm/min速度緩慢出針,以免拔針時藥物溢出。術后牙托粉封固顱骨孔,縫合皮膚,3 d內每日肌注青霉素G10萬U防止感染,并進行模型評價剔除不合格者。

1.4 處理方法

正常組經篩選合格后于(24±2)℃室溫中常規飼養,定時給予充足清潔飲水和定量大鼠專用飼料,不進行任何處理,作為實驗對照組;模型組模型復制成功后不予任何處理;假手術組顱內注射等量生理鹽水,具體方法同模型組,不進行任何處理;針灸組于實驗第3天模型復制成功后(具體方法同模型組),根據華興邦提供的大鼠穴位定位方法,定位大鼠百會(頂骨正中)和腎俞(第2腰椎下兩旁)穴,先針刺百會(向前平刺3～5 mm),腎俞穴(稍向內斜刺5 mm)15 min,然后用美容艾條(f=0.6 cm),于百會和腎俞穴位上方2～3 cm處進行懸灸,使穴位表皮溫度在(43±1)℃,持續15 min,每日1次,7 d為1個療程,共計2個療程,療程間休息1 d。

1.5 標本采集

各組大鼠以10%水合氯醛腹腔麻醉(300 mg/kg),斷頭取腦,迅速在冰盤上剝離腦膜,除去嗅球、延髓和小腦,分離雙側海馬,置于冰箱﹣80℃凍存備用。

1.6 定量RT-PCR法檢測大腦海馬線粒體中Cyp D的表達

1.6.1 引物的設計

通過NCBI查找大鼠CypD基因序列,應用Primer Primers軟件進行引物設計。同樣設計b-actin為內參照,引物由Invitrogen Biotechnology Co,LTD中國公司合成。

CypD引物序列(擴增產物為268 bp),上游5'-TTCCATCTTATGCTCTTCACCG-3';下游5'-GGTTGAAGAAGTCCTTGTCTGC-3'。內參照b-actin引物序列(擴增產物為110bp),上游5'-CGTTGACATCCGTAAAGACCTC-3';下游5'- TAGGAGCCAGGGCAGTAATCT-3'。

1.6.2 腦組織總RNA的提取

①大鼠活體迅速取出大腦海馬部位的腦組織100 mg,加入1 mL Trizol Reagent冰浴勻漿研磨至無可見組織塊,移至1.5 mL EP管中;②加入250mL三氯甲烷,顛倒離心管15 s,充分混勻,靜置3 min,4℃下13000 r/min離心8 min,分層后,取上清液至新的1.5 mL EP管中;③加﹣20℃預冷的0.8倍體積的異丙醇,顛倒混勻,靜置15 min,4℃下13000 r/min離心10 min,管底的白色沉淀即為RNA;④棄上清,加預冷的75%乙醇1.5 mL洗滌沉淀,4℃下13000 r/min離心5 min;⑤倒棄上清,濾紙吸干,將離心管置于超凈臺上吹3 min,加入20mL無RNA酶的水溶解RNA。整個實驗過程中槍頭和離心管均經過濕熱滅菌20 min后干燥,無RNA酶。

1.6.3 反轉錄

①以Oligo(dT)15 1mL為引物,加入含2mgRNA的溶液,用無核糖核酸酶的去離子水補足至12mL,于PCR儀上70℃保溫5 min,迅速置冰上冷卻;②依次加入4mL 5×buffer,2mL 10 mM dNTPs,1mL RNA inhibitor和1mL反轉錄酶,用槍抽吸混勻,于PCR儀上42℃保溫30 min,結束后80℃保溫5 min滅活反轉錄酶。整個實驗過程中槍頭和PCR均經過濕熱滅菌20 min后干燥,無RNA酶。

1.6.4 PCR擴增

①取0.2 mL PCR管,配制下列反應體系,每個反轉錄產物配制3管,2×qPCR Mix 12.5mL;2.5mM基因引物2.0mL;反轉錄產物2.0mL;ddH2O 8.5mL;②另取0.2 mL PCR管,配制下列反應體系,每個反轉錄產物配制3管,2×qPCR Mix 12.5mL;2.5mM內標引物2.0mL;反轉錄產物2.0mL;ddH2O 8.5mL;③反應條件,95℃預變性1 min,95℃變性15 s,72℃退火20 s,共40個循環,72℃末段延伸5 min;對CypD定時PCR產物制作溶解曲線,先將PCR產物升溫至95℃,15 s后降溫至58℃,維持20 s后再升溫至72℃維持20 s,72℃→95℃,每20 s升溫1℃。在此整個過程中連續收集熒光信號,然后繪制熔解曲線并進行特異性分析。

1.6.5 結果處理

以擴增倍數作為比較依據,采用ΔΔCT法進行結果計算,即A=CT(目的基因,實驗樣本)－CT(內標基因,實驗樣本);B=CT(目的基因,對照樣本)－CT(內標基因,對照樣本);K=A－B;表達倍數=2﹣K,計算結果運用SPESS17.0進行統計學分析。

2 結果

2.1 大鼠行為學檢測

實驗前各組大鼠經Morris水迷宮(Morris water maze,MWM)篩選,剔除不合格大鼠;實驗過程中觀察可見模型組大鼠進食飲水量有所減少,毛發光澤度降低,部分可見脫毛伴行動遲緩,對外界刺激降低,而針灸組大鼠進食飲水量正常,對外界刺激反應尚可,較模型組有所改善;實驗過程中運用Morris水迷宮測試大鼠在實驗中逃避潛伏期的長短及跨越原平臺位置的次數,觀察各組大鼠的學習和記憶能力。其中定位航行試驗(place navigation)歷時數天,每天將大鼠面向池壁分別從4個入水點(N、E、S、W)放入水中若干次,記錄其尋找到隱藏在水面下平臺的情況,即為逃避潛伏期;然后進行空間探索試驗(spatial probe)即在定位航行試驗后去除平臺,任選一個入水點將大鼠放入水池中,記錄其在一定時間內的游泳軌跡,觀察各組大鼠對原平臺的記憶能力,即為跨越原平臺次數和有效區停留時間。由表1可見,定位航行試驗中模型組的平均逃避潛伏期較長,而空間探索實驗中的跨越原平臺次數和有效區停留時間較短,與正常組和假手術組相比具有極顯著性差異(＜0.01),提示模型組大鼠學習記憶能力出現明顯的減退,模型復制成功;而經過15 d針灸治療后,能夠有效改善大鼠的學習記憶能力,與模型組相比具有統計學意義(＜0.01),提示針灸能夠有效減輕Ab1-42的神經毒性作用,恢復大鼠正常的學習記憶能力,在行為學上有著明顯的改善。

表1 各組大鼠Morris水迷宮結果比較 (±s)

注:與正常組比較1)＜0.01;與模型組比較2)＜0.01

2.2 大鼠海馬神經元線粒體中CypD結果分析

運用定量RT-PCR法進行檢測,其中實時PCR熔解曲線可見PCR擴增特異性強,提示無明顯的引物二聚體或其他非特異性雜帶出現。PCR擴增期間,將檢測臨界點定在PCR產物進入指數增長期的起始點值處,即Ct值,采用ΔΔCT法計算擴增表達倍數,并將擴增倍數通過統計學分析(見圖1)。模型組表達比正常組和假手術組明顯增高,具有極顯著性差異(＜0.01),提示老年性癡呆發病過程中可能與CypD的過度表達,海馬神經元線粒體膜內外滲透失衡導致線粒體損傷有關;而針灸組CypD的表達明顯降低,與模型組比較差異亦存在統計學意義(＜0.05),提示針灸治療老年性癡呆過程中,可能與其抑制海馬神經元線粒體中CypD的過度表達,阻滯mPTP的形成,從而改善海馬神經元線粒體膜內外滲透失衡,減輕線粒體損傷有關。

與正常組比* P＜0.05,**P＜0.01;與模型組比#P＜0.05,##P＜0.01

3 討論

老年性癡呆屬于中醫學“呆證”、“郁證”、“善忘”、“癲狂”、“不慧”、“愚癡”等范疇。明代《景岳全書》第一次提出癡呆是獨立性疾病。現代醫學認為老年性癡呆是中樞神經系統的一種原發性退行性變性疾病,臨床主要表現為記憶、認知、語言、行為障礙及人格改變,病久可喪失生活自理能力,給家庭、社會造成極大負擔[6-7]。AD患者大腦皮質彌散性萎縮,神經元丟失,突觸減少,Ab沉積形成老年斑(senile plaque,SP)和細胞內tau蛋白異常磷酸化導致神經原纖維纏結(neuro-fibrillarytangle,NFT)形成是其特征性病理變化。盡管引起AD的病因有很多,其中關于線粒體的損傷相關機制研究備受關注[8]。mPTP是線粒體膜滲透轉換功能的結構基礎,它是位于線粒體內外膜之間由多個蛋白質組成的復合通道,又稱為線粒體大通道(megachanel)。mPTP的開放會導致線粒體膜通透性的轉變,而線粒體膜的通透化與神經細胞凋亡存在密切關系,是線粒體損傷機制中三大主要途徑之一。同時,線粒體基質內的CypD是組成線粒體通透性轉換孔mPTP的必需成分之一,其與內膜上的分子磷酸載體結合是mPTP形成的啟動過程。研究顯示[9-11],AD患者Ab沉積的線粒體中CypD表達可見顯著提高,并且可特異性結合形成Ab-CypD復合物,從而促進mPTP開放,導致線粒體膜內外滲透失衡引起功能障礙。而CypD阻滯劑環孢素A(cyclos porine A)可阻滯mPTP形成并改善其對線粒體和細胞的損傷,故CypD在Ab促進mPTP開放中起到重要的作用。

本研究從AD的病因病機出發,以“益腎調督”為主要治療原則,重點選擇百會、腎俞(雙側)穴治療該病。百會又名三陽五會,乃督脈與足太陽、手少陽、足少陽、足厥陰等經脈交會處,具醒神開竅、補腦益智之功;腎俞穴為足太陽膀胱經之背俞穴,是腎精之氣轉輸、匯集于背腰部之處,而且足太陽經經氣與督脈互通,共主一身之陽氣,該穴不僅補益腎氣腎精,而且還調節督脈經氣,經氣通暢,使腎生髓,源源不斷上注于腦,髓海充足,則元神恢復,二穴共用可起到益腎調督之功。從研究結果可以看出,模型組海馬神經元線粒體中CypD的表達明顯高于正常組和假手術組(＜0.01),可見在AD的發病過程中CypD的過度表達可導致mPTP的開放,從而引起線粒體膜內外滲透失衡,導致線粒體損傷促進細胞外b淀粉樣蛋白的沉積和老年斑的形成;通過針灸治療后,CypD的表達明顯下降(＜0.05),提示針灸治療能夠有效抑制CypD的過度表達,阻滯mPTP形成并改善線粒體的損傷,達到防治AD的目的。當然,線粒體損傷機制不僅與線粒體通透性轉換孔有關,還與線粒體能量代謝途徑和線粒體動力學異常途徑有關,至于針灸對另外兩大途徑的影響仍有待進一步研究。

[1] Wang X, Su B, Perry G,. Insights into amyloid-b-induced mitoc- hondrial dysfunction in Alzheimer disease[J]. Free Radic BiolMed, 2007,43(12):1569-1573.

[2] Manczak M, Calkins MJ, Reddy PH. Impaired mitochondrial dynam- ics and abnormal interaction of amyloid beta with mitochondrial protein Drp1 in neurons from patients with Alzheimer’s disease: implications for neuronal damage[J]. Hum Mol Genet, 2011,20(13): 2495-2509.

[3] Reddy PH, Tripathi R, Troung Q,Abnormal mitochondrial dynamics and synaptic degeneration as early events in Alzheimer’s disease[J]. Biochim Biophys Acta, 2012,1822(5):639-649.

[4] 杜艷軍,周華,孫國杰,等.針灸預處理對AD大鼠海馬組織超微形態學的影響[J].中華中醫藥學刊,2011,29(6):1234-1236.

[5] Paxinos. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates Compact ThirdEdi- tion[M]. Academic Press, 2005:8.

[6] 靳翔愚.針灸治療老年性癡呆進展[J].河南中醫,2010,30(4):415 -417.

[7] 王小月,周麗莎.針灸治療阿爾茨海默病研究近況[J].內蒙古中醫藥,2007,(7):49-52.

[8] Beal MF. Mitochondrial dysfunction in neurodegenerative diseases[J]. Biochim Biophys Acta, 1998,1366(1-2):211-223.

[9] Mouri A, Noda Y, Shimizu S,. The role of cyclophilin D in learning and memory[J]. Hippocampus, 2010,20(2):293-304.

[10] Du H, Guo L, Fang F,. Cyclophilin D deficiency attenu- ates mitochondrial and neuronal perturbation and ameliorates learning and memory in Alzheimer’s disease[J]. Nat Med, 2008,14(10):1097 -1105.

[11] Du H, Guo L, Zhang W,. Cyclophilin D deficiency impro- ves mitochondrial function and learning/memory in aging Alzheimer disease mouse model[J]. Neurobiol Aging, 2011,32(3):398-406.

Effects of Acupuncture and Moxibustion on Mitochondrial Cyclophilin D in Hippocampal Neurons in A Rat Model of Alzheimer Disease

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,430065,

To explore the mechanism of preventive and therapeutic actions of acupuncture and moxibustion on Alzheimer disease (AD) by using quantitative RT-PCR to investigate their effects on the expression of cyclophilin D (CypD) gene in hippocampal neuronal mitochondria in a rat model of AD.The rat model was made by injecting Ab1-42 into the hippocampus. Rats were randomly allocated to normal, sham operation, model and acupuncture -moxibustion groups. Acupuncture at and moxibustion on points Baihui (GV20) and Shenshu (BL23) were performed for treatment. The level of CypD mRNA expression in hippocampal neuronal mitochondria was measured using quantitative RT-PCR in a rat model of AD.The observation of rat behaviors found that in the acupuncture -moxibustion group of rats, food and water intakes were normal, and responses to external stimuli existed and improved somewhat compared with the model group. Statistical analysis of the expansion fold of CypD gene expression in rat hippocampal neuronal mitochondria showed that CypD expression in hippocampal neuronal mitochondria was significantly higher in the model group of rats than in the normal and sham operation groups (＜0.01) and significantly lower in acupuncture -moxibustion group than in the model group (＜0.05), suggesting that acupuncture and moxibustion could effectively inhibit CypD overexpression in hippocampal neuronal mitochondria to improve an inside-outside imbalance in mitochondrial membrane permeability and reduce injury to mitochondria in hippocampal neurons.Acupuncture–moxibustion prevention and treatment of AD may be related to its inhibiting CypD overexpression in mitochondria, checking mPTP formation and reducing injury to mitochondria in rat hippocampal neurons.

Acupuncture-moxibustion therapy; Alzheimer disease; Rats; RT-PCR; CypD

R2-03

A

10.3969/j.issn.1005-0957.2013.12.1056

1005-0957(2013)12-1056-04

國家自然科學基金項目(81173323,81273864)

羅磊(1983 - ),男,2011級博士生

杜艷軍(1975 - ),女,副教授,博士

2013-05-20