霉酚酸酯對IgA腎病大鼠腎組織中TGF－β1及Smad2/3表達的影響

高嫻緋，趙凱姝，翟淑波，馬青山

(吉林大學白求恩第一醫院，長春130021)

IgA腎病(IgAN)是世界范圍內最常見的原發性腎小球疾病，以腎小球系膜區有大量顆粒性IgA或以IgA為主的循環免疫復合物沉積為特征，其發病機制目前不清。轉化生長因子-β1(TGF-β1)、Smad蛋白已被證實為IgAN病理機制中的關鍵性因子［1］。大量臨床研究證實，免疫抑制劑霉酚酸酯(MMF)聯合激素治療IgAN有較好的臨床效果［2］。本研究觀察了MMF對IgAN大鼠腎組織中TGF-β1及其信號轉導分子Smad2/3表達的影響，旨在進一步探討MMF治療IgAN的效果及可能作用機制。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 實驗動物 SPF級6周齡健康清潔級雄性Wistar大鼠24只，體質量(180±20)g，由吉林大學白求恩醫學部實驗動物中心提供。按照SPF級飼養，自由進食和飲水，適應性飼養1周。

1．1．2 主要試劑與藥物 牛血清白蛋白(Bevine Serum albumin，BSA)購自上海生物工程有限公司;脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)購自美國Sigma公司;異硫氰酸熒光素標記兔抗大鼠IgA抗體、TGF-β1抗體、Smad2/3抗體購自北京博奧森生物技術有限公司;MMF購自上海羅氏制藥有限公司。

1．2 實驗方法

1．2．1 動物分組及處理 將24只大鼠隨機分為對照組、MMF組、模型組各8只。后兩組均參考文獻［3］建立IgAN模型:自實驗第1天起以BSA 400 mg/kg(蒸餾水配成水溶液4 mL/kg)隔日灌胃1次，共8周;皮下注射蓖麻油 0．3 mL+CCl40．1 mL，每周 1次，持續9周;第6周自尾靜脈注射LPS 0．05 mg/只(用0．9%NaCl配成溶液0．5 mL)。自第9周開始，MMF組予MMF 10 mg/(kg·d)每日灌胃1次，對照組和模型組予等量蒸餾水灌胃，持續至12周末。

1．2．2 尿液指標檢測 分別于第 4、6、8、10、12 周末將各組大鼠放入代謝籠，收集24 h尿液，4 000 r/min離心10 min后取上清，用考馬斯亮藍法檢測24 h尿蛋白定量;取尿沉渣用光學顯微鏡計數紅細胞。

1．2．3 血清學指標檢測 各組均于第12周末以3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后自腹主動脈取全血，以3 000 r/min離心10 min分離血清。用全自動生化分析儀測定血 BUN、SCr、ALT、AST、總蛋白(TP)、Alb、TG、CH。

1．2．4 腎組織病理學檢測 實驗結束后取各組大鼠腎組織標本，經固定、脫水、透明、石蠟包埋，切片3μm厚。HE染色觀察腎組織病理學改變。用直接法進行免疫熒光染色，熒光顯微鏡下觀察有無IgA沉積，電鏡下觀察腎組織病理超微結構改變。

1．2．5 腎組織 TGF-β1、Smad2/3表達的檢測 用SP免疫組織化學方法檢測TGF-β1、Smad2/3定位和表達。取各組大鼠腎組織標本，經固定、脫水、透明、石蠟、包埋，切片3μm厚，80℃烘烤3 h;經二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化;蒸餾水洗1 min，PBS沖洗3次;滴加3%過氧化氫溶液室溫放置10 min，以消除內源性過氧化物酶;PBS洗3次;滴加正常山羊免疫血清封閉液，室溫放置15 min，傾去血清，勿洗，滴加按1∶100稀釋的Smad2、Smad3特異性一抗，4℃冰箱過夜;PBS沖洗3次;滴加生物素標記的二抗，室溫10 min;PBS洗5 min×3次;滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，室溫10 min;PBS洗5 min×3次;DAB顯色，顯微鏡下作用1～2 min，至顯色滿意，蒸餾水終止顯色。蘇木素復染，鹽酸乙醇分化，流水沖洗返藍1 min，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。細胞質染呈棕黃色，細胞核由蘇木素復染為藍色為陽性表達判定標準。所得數據采用Motic Images Advanced 3．2圖像分析儀獲取灰度值。

1．3 統計學方法 采用SPSS17．0統計軟件。計量數據以±s表示，資料正態分布且方差齊時，多組比較采用單因素方差分析(ANOVA)，組間兩兩比較采用LSD法;資料偏態分布或方差不齊時，多組比較采用秩和檢驗(Kruskal-Wallis法)，組間兩兩比較用Nemenyi法。P≤0．05為差異有統計學意義。

2 結果

2．1 尿液指標

2．1．1 尿紅細胞計數 0至第4周末，三組尿紅細胞計數相比差異無顯著性(P＞0．05);第6～8周末，模型組與MMF組尿紅細胞計數均明顯升高，與對照組相比差異有顯著性(P＜0．05);第10～12周末，MMF組尿紅細胞計數較模型組明顯減少，差異有顯著性(P ＜0．05)，詳見表1。

2．1．2 24 h尿蛋白定量 0至第6周末，三組24 h尿蛋白定量相比差異無顯著性(P＞0．05);第6～8周末，模型組與MMF組24 h尿蛋白定量明顯升高，與對照組相比差異有顯著性(P＜0．05);第10～12周末，MMF組24 h尿蛋白定量較模型組明顯減少，差異有顯著性(P＜0．05)，詳見表2。

表1 三組尿紅細胞計數比較(個/μL±s)

表1 三組尿紅細胞計數比較(個/μL±s)

注:與對照組相比，*P ＜0．05;與模型組相比，△P ＜0．05

時間 n尿紅細胞計數0周 4周 6周 8周 10周 12周模型組 8 28．00 ±10．06 51．67 ±24．94 181．50 ±51．38* 245．83 ±42．67* 256．83 ±35．53* 245．67 ±48．64*MMF 組 8 34．67 ±19．96 44．33 ±16．40 169．33 ±46．58* 227．00 ±33．13* 184．67 ±35．00＊△ 138．33 ±35．88＊△對照組 8 27．83 ± 6．49 32．33 ±14．45 38．83 ±16．04 42．33 ±21．89 40．83 ±20．32 35．33 ±14．47

2．2 血生化指標 模型組與MMF組血清BUN、

表2 三組24 h尿蛋白定量比較(mg/24 h±s)

表2 三組24 h尿蛋白定量比較(mg/24 h±s)

注:與對照組相比，*P ＜0．05;與模型組相比，△P ＜0．05

時間 n尿蛋白0周 4周 6周 8周 10周 12周模型組 8 3．93 ±1．549 5．34 ±0．739 5．09 ±1．250 12．18 ±3．311* 11．85 ±2．030* 11．06 ±1．641*MMF 組 8 4．35 ±1．079 4．61 ±1．209 5．10 ±2．119 11．00 ±2．521* 9．26 ±1．915＊△ 8．71 ±1．699＊△對照組 8 4．61 ±1．293 4．28 ±1．065 4．18 ±1．058 4．09 ±1．074 3．95 ±0．933 4．65 ±0．824

SCr、ALT、AST、TP、ALB、TG、CH 與對照組相比，差 異無顯著性(P ＞0．05)，詳見表3。

表3 三組血生化指標比較±s)

表3 三組血生化指標比較±s)

組別 n BUN(mmol/L)SCr(μmol/L) ALT(U/L) AST(U/L) TP(g/L) ALB(g/L) TG(mmol/L)CH(mmol/L)MMF 組 8 7．20 ±0．77 28．95 ±3．12 48．17 ± 8．29 143．67 ±35．57 54．95 ±12．95 32．97 ±2．31 1．33 ±0．23 1．33 ±0．17模型組 8 7．77 ±0．33 29．30 ±2．18 51．67 ± 8．55 138．50 ±23．93 50．05 ±13．58 32．05 ±0．93 1．38 ±0．23 1．42 ±0．18對照組 8 6．90 ±1．02 26．82 ±4．19 46．50 ±10．51 146．00 ±21．56 62．83 ±14．65 35．00 ±2．10 1．17 ±0．26 1．29 ±0．17

2．3 腎組織病理學改變 光鏡下，對照組腎小球系膜細胞及基質無增生，毛細血管襻開放，腎小球、腎小管、間質結構正常;模型組腎小球系膜細胞增生，系膜基質增多，毛細血管管腔狹窄，腎小管間質有較多炎細胞浸潤，腎小管上皮細胞腫脹變性;MMF組病理改變較模型組有所減輕，腎小球系膜細胞、系膜基質輕度增生，毛細血管管腔輕度狹窄，腎小管上皮細胞輕度變性，少量炎細胞浸潤。電鏡下，對照組腎小球足細胞足突正常，基底膜完整、均勻一致，系膜區系膜細胞無增生，腎小管上皮細胞正常;模型組系膜區基質內可見較多電子致密物，腎小囊內微絨毛化，毛細血管腔變大;MMF組系膜區改變較模型組減輕，腎小管上皮細胞未見壞死，毛細血管襻開放好。熒光顯微鏡下，對照組腎小球系膜區無IgA沉積;模型組腎小球系膜區有黃綠色強IgA熒光;MMF組腎小球系膜區內IgA黃綠色熒光強度較模型組減弱。

2．4 腎組織中TGF-β1及 Smad2、Smad3的表達與分布 對照組大鼠腎組織中有少量 TGF-β1及Smad2、Smad3 表 達;模 型組 TGF-β1 及 Smad2、Smad3陽性表達增強;MMF組 TGF-β1及 Smad2、Smad3表達較模型組減弱，其灰度值詳見表4。

表4 三組腎組織中TGF-β1、Smad2、Smad3灰度值比較(n=8±s)

表4 三組腎組織中TGF-β1、Smad2、Smad3灰度值比較(n=8±s)

注:與對照組相比，*P ＜0．05;與模型組相比，△P ＜0．05

組別 TGF-β1 Smad2 Smad3 MMF 組 125．40 ±2．95＊△ 135．37 ±2．26＊△ 133．07 ± 7．63＊△模型組 72．98 ±2．08* 80．80 ±5．97* 97．67 ±15．13*對照組199．98 ±5．80 193．48 ±6．16 219．77 ±11．41

3 討論

研究顯示，IgAN的預后差異較大，部分患者以進行性腎臟損傷為顯著特征。近年來研究表明，在確診IgAN的20 a內有15%～40%的患者進入終末期腎病(End-stage renal disease，ESRD)［4］，由于腎小管纖維化被視為導致終末性腎臟衰竭的最終途徑［5］，采取有效措施控制腎纖維化的發展成為控制該病進展的關鍵環節。

研究證實，TGF-β1既是導致IgAN的中間因子，亦是加重腎臟損傷和纖維化的關鍵因素，其高表達于IgAN患者和系膜增生型腎小球硬化模型中［1，6，7］，且在系膜增生型腎小球硬化模型的實驗研究中，TGF-β1拮抗劑可減輕IgAN患者的腎小球硬化［8］。與普通人群相比，有高表達 TGF-β1基因的患者，TGF-β1蛋白表達越高，其腎臟損傷也愈重［9］。對處于IgAN早期炎癥改變階段的患者，TGF-β1蛋白是導致細胞增生和分泌的細胞因子［10］。因此，TGF-β1被視為反映IgAN預后及治療效果的關鍵指標［11］。Smad蛋白是使 TGF-β1目的基因表達的細胞內關鍵性調節因子，根據作用不同可分為三類［12］:受體激活型如 Smad1、Smad2、Smad3，共同介質型如Smad4，抑制型如Smad6、Smad7等。TGF-β1與胞膜上相應受體結合后，能引起受體激活型Smad2/3蛋白磷酸化，進而吸引共同介質型Smad4形成復合物，轉移至核內，調節轉錄活動，加速纖維化進展［13］。大量研究表明，在IgAN患者及IgAN動物模型中 TGF-β1、Smad2/3 的表達升高［14～17］。近年來的大量藥物研究發現，多種對于IgAN療效顯著的藥物，可通過降低Smad2/3及 TGF-β1表達延緩 IgAN大鼠腎臟病變惡化的持續進展［15，16］。上述研究表明，Smad蛋白增多可導致 TGF-β1表達升高，進而加重IgAN病變進展。因此，可通過降低Smad蛋白水平下調TGF-β1表達，從而減輕IgAN病變程度。

MMF聯合激素治療IgAN療效肯定，能顯著降低尿蛋白水平、保護腎功能，且毒副作用相對較少、患者耐受性好［2］。在MMF緩解單側輸尿管梗阻大鼠模型［18］、糖尿病大鼠模型等腎臟損傷病理機制的研究中，學者認為機制可能為通過減少Smad2/3蛋白、下調TGF-β1的過度表達而發揮腎臟保護作用。本研究中，第6～8周末模型組及MMF組24 h尿蛋白定量、尿液紅細胞計數均顯著高于對照組，腎臟病理改變均重于對照組;模型組較對照組腎組織中TGF-β1及Smad2/3表達升高。提示前兩組成功建立IgAN模型，根據其腎臟病理表現及造模時長判定為早期輕微病變型;TGF-β1及Smad2/3為IgAN病理機制中的關鍵性因子，輕微病變早期時兩者表達即升高，且腎臟病理改變越重，表達水平升高越明顯。故TGF-β1及Smad2/3可能成為反映IgAN腎臟病變嚴重程度的敏感指標。本研究還顯示，第10～12周末MMF組24 h尿蛋白定量、尿液紅細胞計數均顯著低于模型組，腎臟病理改變輕于模型組，TGF-β1、Smad2/3表達低于模型組。提示 MMF治療IgAN有效，機制可能是通過下調Smad2/3表達，而減少TGF-β1的過量表達、延緩IgAN的進展。有關MMF對IgAN治療的確切機制及療效還需要進一步深入研究和大量的循證醫學證據來證實。

綜上所述，MMF治療IgAN的病理機制可能是通過下調Smad2/3、TGF-β1表達發揮腎臟保護作用。

［1］Li XZ，Feng JT，Hu CP，et al．Does Arkadia contribute to TGF-β1-induced IgA expression through up-regulation of Smad signaling in IgA nephropathy［J］．Int Urol Nephrol，2010，42(3):719-722．

［2］Tasanarong A，Thitiarchakul S．Mycophenolate mofetil treatment in primary glomerular disease:one-year follow-up in steroid dependent and resistant nephrotic syndrome［J］．J Med Assoc Thai，2006，89(Suppl 2):S218-227．

［3］湯穎，婁探奇，成彩聯，等．實驗性IgA腎病模型的改進［N］．中山大學學報(醫學科學版)，2006，27(2):184-187．

［4］Lai AS，Lai KN．Molecular basis of IgA nephropathy［J］．Curr Mol Med，2005，5(5):475-487．

［5］Eddy AA．Molecular insights into renal interstitial fibrosis［J］．J Am Soc Nephrol，1996，7(12):2495-2508．

［6］Border WA，Noble NA．TGF-beta in kidney fibrosis:a target for gene therapy［J］．Kidney Int，1997，51(5):1388-1396．

［7］Yoshioka K，Takemura T，Murakami K，et al．In situ expression of cytokines in IgA nephritis［J］．Kidney Int，1993，44(4):825-833．

［8］Border WA，Noble NA，Yamamoto T，et al．Antagonists of transforming growth factor-beta:a novel approach to treatment of glomerulonephritis and prevention of glomerulosclerosis［J］．Kidney Int，1992，41(3):566-570．

［9］Lim CS，Kim YS，Chae DW，et al．Association of C-509T and T869Cpolymorphisms of transforming growth factor-beta1 gene with susceptibility to and progression of IgA nephropathy［J］．Clin Nephrol，2005，63(2):61-67．

［10］Wang F，Xie X，Fan J，et al．Expression of P311，a transforming growth factor beta latency-associated protein-binding protein，in human kidneys with IgA nephropathy［J］．Int Urol Nephrol，2010，42(3):811-819．

［11］周瑩，呂吟秋，杜園園，等．TGF-β1與I gAN腎小管間質病變相關性研究［J］．山東醫藥，2009，49(8):30-32．

［12］Massague RP．Transcriptional control by the TGF-β1/Smad signaling system［J］．EMBO，2000，19(8):1745-1754．

［13］Javelaud D，Mauviel A．Mammalian transforming growth factor-beta Smad signaling and physio-pathological role［J］．Int J Biochem Cell Biol，2004，36(7):1161-1165．

［14］Wu W，Jiang XY，Zhang QL，et al．Expression and significance of TGF-beta1/Smad signaling pathway in children with IgA nephropathy［J］．World J Pediatr，2009，5(3):211-215．

［15］黃國東，許健，姜云，等．復方仙草顆粒對 IgA腎病腎小球硬化大鼠TGF-β/Smads信號通路的影響［J］．時珍國醫國藥，2010，21(11):2822-2824．

［16］張霞，丁櫻．清熱止血顆粒(血尿停)對IgA腎病模型大鼠TGF-β1/Smad信號轉導通路的影響及機理探討［D］．河南中醫學院，2006:12．

［17］蔣小云，吳偉，張巧玲，等．IgA腎病患者血清IgA1對人腎小球系膜細胞轉化生長因子β1/Smads信號通路的影響［J］．中華生物醫學工程雜志，2009，15(4):203-207．

［18］張浩，唐靜，張顯明，等．霉酚酸酯對UUO大鼠腎間質p-Smad2/3表達的影響［J］．醫學臨床研究，2006，12(23，12):1910-1913．