五步蛇毒抗凝血作用機制的研究

余 雷，何華晉，唐榕英，寧 宗

(1廣西醫科大學第一附屬醫院，南寧530021;2柳州市工人醫院;3廣西醫科大學研究生院)

五步蛇又稱尖吻蝮，在我國主要分布在長江流域及其以南地區，山區較為多見［1］。五步蛇傷病例在臨床上很常見，因其咬傷與彌散性血管內凝血(DIC)有類似的臨床表現，多年來一直被認為是引起DIC的病因之一［2］。近年來，Isbisterd等指出五步蛇咬傷引起的臨床表現是蛇毒誘導的消耗性凝血障礙(Venom-induced consumption coagulopathy，VICC)［3，4］。本實驗通過建立大鼠五步蛇毒中毒模型，檢測大鼠凝血功能、凝血因子(Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ)活性及部分血常規指標，并于光鏡下觀察了肺臟微循環改變，旨在探討五步蛇咬傷所致凝血功能障礙的發生機制。

1 材料與方法

1．1 動物及試劑 健康清潔級 Sprague-Dawley(SD)大鼠30只，雌雄各半，體質量180～200 g(合格證:SCXK桂2010-2011)，由廣西醫科大學實驗動物中心提供;五步蛇毒白色凍干粉(批號100228)，江西鷹潭蛇場廣州辦事處提供。

1．2 動物分組及模型制作 參考黃松等［4］文獻，將五步蛇毒白色凍干粉與0．9%氯化鈉注射液按5∶1(每5 mg五步蛇毒溶于1 mL生理鹽水中)配成蛇毒溶液。將30只SD大鼠隨機分為實驗組和對照組各15只，分別予0．35 mL蛇毒溶液及等量生理鹽水腹腔內注射，其后均常規喂養。

1．3 觀察指標及標本采集 腹腔注射藥物24 h內觀察大鼠的行為表現，包括精神狀態、活動、進食、呼吸頻率、對刺激的反應等。24 h后，10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠(300 mg/kg)，麻醉成功后立即沿腹正中線切開暴露腹腔，經腹主動脈采血4．0 mL(其中2．0 mL注入EDTA抗凝管，余2．0 mL注入枸櫞酸鈉抗凝管)，立即送廣西醫科大學第一附屬醫院檢驗科檢查凝血功能指標PT、纖維蛋白原(Fg)、凝血因子(Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ)活性及血常規指標 WBC、RBC、Hb、PLT;迅速切開胸腔，觀察胸腹腔各臟器的形態學變化;剪取大鼠右上肺葉，放入10%甲醛溶液中固定，石蠟包埋固定后切片，HE染色后送廣西醫科大學第一附屬醫院病理科，光鏡下觀察肺臟微血管內有無微血栓形成。

1．4 統計學方法 采用SPSS16．0統計軟件。計量資料以ˉx±s表示，組間比較采用t檢驗。P≤0．05為差異有統計學意義。

2 結果

2．1 兩組行為表現及解剖發現 ①行為表現:腹腔注射藥物30 min后兩組均未出現死亡，實驗組均出現不同程度的懶動、嗜睡、呼吸深快、反應遲鈍、步態不穩、拖步等表現，對照組無明顯異常。②解剖發現:24 h后實驗組腹腔注射部位周圍皮下均可見大小不等的瘀斑，未見局部組織壞死，腹腔內有較多不凝血液，胃、腸及腸系膜表面可見散在出血點，胸腔內未發現積血;對照組無明顯異常。

2．2 兩組血常規指標及凝血功能指標比較 與對照組比較，24 h后實驗組PLT計數明顯減少(P＜0．05)、WBC 計數明顯增高(P ＜0．05)，RBC 計數及Hb均無明顯變化(P均＞0．05)，詳見表1;實驗組血清Fg明顯下降(P＜0．05)，PT和凝血因子Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ活性無明顯變化(P均＞0．05)，詳見表2。

2．3 兩組肺臟組織光鏡下表現 對照組肺泡及支氣管結構清晰，肺泡壁內毛細血管、小血管清晰可辨，毛細血管內紅細胞多為1～2個，未見微血栓，肺泡腔未見滲出(見圖1，A、B圖均為200×)。實驗組肺泡及支氣管結構清晰，肺泡壁內毛細血管、小血管清晰可辨，肺泡間隔稍增厚，少數毛細血管內紅細胞超過2個，部分肺泡上皮及血管內皮細胞輕度腫脹，未見微血栓，肺泡腔亦未見滲出(見圖2，C圖為100×，D圖為400×)。

表1 兩組 RBC、Hb、PLT 比較(n=15±s)

表1 兩組 RBC、Hb、PLT 比較(n=15±s)

組別 RBC(×109/L) Hb(g/L) WBC(×109/L)PLT(×109/L)實驗組 6．31 ±0．25 138．40 ±4．86 10．22 ±0．81 14．48 ± 7．99對照組 6．44 ±0．37 139．00 ±3．39 6．13 ±1．08 938．20 ±188．99

表2 兩組PT、Fg及凝血因子Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ活性比較(n=15 ± s)

表2 兩組PT、Fg及凝血因子Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ活性比較(n=15 ± s)

組別 PT(s)Fg(g/L)凝血因子Ⅷ(%)凝血因子Ⅸ(%)凝血因子Ⅺ(%)實驗組 9．40 ±0．46 0．64 ±0．19 231．56 ±3．24 40．24 ±1．76 50．80 ±2．59對照組 9．40 ±0．46 2．63 ±0．11 231．04 ±5．25 40．88 ±4．33 50．49 ±3．09

圖1 對照組大鼠光鏡下肺臟組織表現

圖2 實驗組大鼠光鏡下肺臟組織表現

3 討論

五步蛇咬傷病例臨床上很常見，國內外近年來有報道指出，蛇咬傷并非一定引起DIC，而可能是“非典型DIC”或者“VICC”。關于蛇咬傷患者合并微血管病變而非出現急性DIC的報道，可能是因為部分此類患者的癥狀能在治療數周后緩解而無明顯后遺癥［7］，與急性DIC的惡性進展不一致。由于臨床診斷的局限性，上述結論多半是通過臨床表現與臨床實驗室檢查結果推測得出，并未有微循環的病理學依據。本研究顯示，腹腔注射藥物30 min后兩組均未出現死亡，實驗組均出現不同程度的懶動、嗜睡、呼吸深快、反應遲鈍、步態不穩、拖步等表現;注藥24 h后實驗組腹腔注射部位周圍皮下均可見大小不等的瘀斑，未見局部組織壞死，腹腔內有較多不凝血液，胃、腸及腸系膜表面可見散在出血點，胸腔內未發現積血。提示實驗組均出現一定中毒癥狀，且有急性出血表現。但本研究中肺組織HE染色發現，實驗組肺泡及支氣管結構清晰，肺泡壁內毛細血管、小血管清晰可辨，肺泡間隔稍增厚，少數毛細血管內紅細胞超過2個，部分肺泡上皮及血管內皮細胞輕度腫脹，未見微血栓，肺泡腔亦未見滲出。初步推測五步蛇毒并未導致大鼠的微循環功能障礙，其通過內、外源性凝血系統引起大鼠發生DIC的可能性不大。可能只是一種消耗性凝血功能障礙，即VICC狀態。當然，該實驗不能排除染毒大鼠肺臟內曾有微血栓形成但被繼發亢進的纖溶系統清除或其他終末器官內有微血栓形成的可能;另一種可能是和模型建立使用的中毒劑量有關。臨床上亦有用五步蛇毒類凝血酶來抗血栓［8］，在治療量或者過量情況下也引起凝血功能障礙，但未見有發生DIC的報道，此與本研究結論一致。

本研究還顯示，與對照組比較，實驗組PLT計數明顯減少、WBC計數明顯增高，RBC計數及Hb均無明顯變化;實驗組血清Fg明顯下降，PT和凝血因子Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ活性無明顯變化。提示:①蛇毒可能直接消耗體內的PLT，阻止血小板性血栓形成;蛇毒中的類凝血酶成分能直接作用于Fg，裂解其血纖肽A，產生不交聯蛋白，此蛋白很快可被機體網狀內皮系統吞噬和被循環血液清除;此外，蛇毒中的纖溶成分能直接溶解纖維蛋白，進一步導致Fg消耗。②實驗組WBC增高可能與中毒、機體出血引起的應激反應有關;RBC、Hb未見明顯下降，而大鼠腹腔內及多個臟器均發現有出血的原因，可能是五步蛇毒引起的損傷屬于急性出血(未直接引起溶血和廣泛性紅細胞性血栓形成)及急性中毒反應所致血液濃縮。PT和凝血因子Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ無明顯變化的原因考慮可能是染毒24 h內經歷了凝血因子消耗、再恢復的過程;五步蛇毒或許對凝血因子無明顯影響。

綜上所述，五步蛇毒所致機體以出血為主的特征性改變屬于機體消耗性凝血功能障礙。

［1］張啟宇．內科手冊［M］．南京:江蘇科學技術出版社，2007:1577．

［2］ Levi M．Disseminated intravascular coagulation［M］．Crit Care Med，2007:2191-2195．

［3］Isbister GK，Little M，Cull G，et al．Thrombotic microangiopathy from Australian brown snake(Pseudonaja)envenoming［J］．Intern Med，2007，37(8):523-528．

［4］黃松，黃接棠．烏梢蛇血清的抗出血因子:一個有前途的抗蛇毒藥物原料(英文)［J］．動物學報，2006，52(6):1113-1118．

［5］Isbister GK，Duffull SB，Brown SG．Failure of antivenom to improve recovery in Australian snakebite coagulopathy［J］．QJM，2009，2(8):563-568．

［6］寧宗，李其斌．廣西竹葉青蛇咬傷后血液學動態變化及發生非典型 DIC 的觀察分析［J］．中國急救醫學，2010，30(9):835-837．

［7］Isbister GK．Snakebite doesn't cause disseminated intravascular coagulation:coagulopathy and thrombotic microangiopathy in snake envenoming［J］．Semin Thromb Hemost，2010，36(4):444-451．

［8］歐光武，李威．尖吻蝮蛇類凝血酶的研究現狀［J］．中國醫藥導報，2010，7(12):9-11．