肺通口服液對(duì)大鼠急性肺損傷的治療作用及其機(jī)制

張 欣，王丁丁，牟 潔

(1青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，山東青島266003;2濟(jì)南市第四人民醫(yī)院;3山東醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校藥學(xué)系)

急性肺損傷(ALI)以大量活化的中性粒細(xì)胞(PMN)在肺血管和間質(zhì)聚集為病理特征，活化的PMN釋放中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(NE)，損傷毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞，消化和降解細(xì)胞外基質(zhì)及上皮連接結(jié)構(gòu)，參與和啟動(dòng) ALI的發(fā)生［1］。本研究觀察了肺通口服液對(duì)ALI大鼠血清中NE含量的影響，旨在探討其對(duì)ALI的治療作用及機(jī)制。

1材料與方法

1．1 材料 40只雄性SD大鼠，體質(zhì)量180～200 mg，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供;博來霉素(8 mg/支)購(gòu)自天津太和制藥有限公司;氫化考的松(25 mg/支)購(gòu)自天津生物化學(xué)制藥廠;肺通口服液(20 mL/支)購(gòu)自濟(jì)南宏濟(jì)堂制藥有限公司;Anti-Elastase NE抗體IgG試劑盒96T購(gòu)于德國(guó)BL公司。

1．2 實(shí)驗(yàn)方法

1．2．1 動(dòng)物分組及處理 取40只雄性SD大鼠，隨機(jī)分為模型組、治療組、激素組、正常對(duì)照組各10只。①模型組:采用BLEMA5法制備肺間質(zhì)纖維化模型。用2%戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，以仰臥位固定在鼠板上，固定四肢、頭部，用開鼻器撬開口腔后將舌輕輕拉出，壓迫舌腹，暴露喉頭，在額鏡注視下，在大鼠吸氣瞬間迅速將與1 mL注射器相連的鈍頭9號(hào)腰穿針插入氣管，約達(dá)氣管分叉處，緩慢注入5 mg/kg平陽(yáng)霉素(用生理鹽水0．5 mL/mg溶解)和0．5 mL空氣，其后立即將動(dòng)物直立旋轉(zhuǎn)，使藥物在肺內(nèi)分布均勻(如發(fā)生窒息，立即進(jìn)行人工心臟按摩)，動(dòng)物清醒后常規(guī)飼養(yǎng)28 d。②治療組:按模型組方法一次性氣管內(nèi)注入平陽(yáng)霉素，24 h后每日予肺通口服液250 mg/kg(用生理鹽水溶解后2～4 mL/只)灌胃1次，共28 d。③激素組:按模型組方法一次性氣管內(nèi)注入平陽(yáng)霉素，24 h后每日肌注氫化考的松25 mg/kg，共28 d。④正常對(duì)照組:按模型組處理，僅將氣管內(nèi)注入藥物改為生理鹽水2 mL/kg，常規(guī)飼養(yǎng)28 d。

1．2．2 標(biāo)本取材 各組于實(shí)驗(yàn)14、28 d分別經(jīng)左側(cè)頸內(nèi)靜脈抽取靜脈血2 mL，其后經(jīng)腹主動(dòng)脈放血處死，立即開胸取右肺中葉，置于4%多聚甲醛/0．1 PBS(pH 值7．0～7．4)中，以含 1/1 000 DEPC 的固定液固定1 h，常規(guī)脫水、浸蠟、包埋，切片厚度為6～8μm。

1．2．3 肺組織形態(tài)學(xué)觀察 ①大體所見。②HE染色:按Szapie方法確定肺泡炎和肺間質(zhì)纖維化程度。肺泡炎分為四級(jí)，其中0級(jí)指無肺泡炎(－);1級(jí)指輕度肺泡炎(+)，受累面積＜全肺20%;2級(jí)指中度肺泡炎(++)，受累面積占20% ～50%;3級(jí)指中度肺泡炎(+++)，受累面積＞50%。肺間質(zhì)纖維化分為四級(jí)，其中0級(jí)指無肺間質(zhì)纖維化(－);1級(jí)指輕度肺間質(zhì)纖維化(+)，病變范圍局限在全肺20%以下;2級(jí)指中度肺間質(zhì)纖維化(++)，病變范圍占全肺20% ～50%;3級(jí)指重度肺間質(zhì)纖維化(+++)，病變范圍＞50%，肺泡融和，肺實(shí)質(zhì)結(jié)構(gòu)紊亂。③VG染色:觀察肺泡膠原沉積和纖維化情況。

1．2．4 血清NE含量檢測(cè) 取實(shí)驗(yàn)14、28 d抽取的靜脈血，靜置15 min，4℃下3 000 r/min離心15 min，離心半徑15 cm，收集血清，40℃保存。用ELISA法測(cè)定血清NE含量。

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13．0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量數(shù)據(jù)用±s表示，各組樣本均數(shù)的比較采用方差分析。P≤0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 各組肺組織形態(tài)學(xué)變化 ①大體所見:正常對(duì)照組雙肺外觀無異常，表面光滑、飽滿，呈粉紅色;模型組表面凹凸不平，多呈暗紅色，邊緣有點(diǎn)狀出血，部分肺葉體積縮小、呈灰白色、表面有白色結(jié)節(jié);治療組與正常對(duì)照組相似，部分肺葉呈暗紅色;激素組與模型組相似，部分肺葉表面光滑。②HE染色:正常對(duì)照組肺泡及間隔結(jié)構(gòu)正常;模型組可見肺泡結(jié)構(gòu)破壞，灶性纖維化形成，分布不均，肺泡間隔增厚，部分肺泡腔縮小甚至消失，肺實(shí)質(zhì)結(jié)構(gòu)紊亂，部分局部炎細(xì)胞浸潤(rùn);治療組可見肺泡間隔增厚程度減輕，炎性細(xì)胞較少，肺泡結(jié)構(gòu)基本正常;激素組肺泡炎及纖維化減輕不甚明顯。模型組肺泡炎以1、2級(jí)為主，肺間質(zhì)纖維化以2、3級(jí)為主;治療組肺泡炎及肺間質(zhì)纖維化均為0級(jí)或1級(jí);激素組肺泡炎主要為1級(jí)，肺間質(zhì)纖維化以1、2級(jí)為主。③VG染色:正常對(duì)照組肺泡結(jié)構(gòu)正常，偶見膠原纖維;模型組肺實(shí)質(zhì)結(jié)構(gòu)紊亂，可見肺間質(zhì)大量紅色膠原纖維沉積，肺泡腔縮小;治療組膠原纖維較少，肺實(shí)質(zhì)結(jié)構(gòu)基本正常;激素組可見不同程度的膠原纖維沉積。

2．2 各組血清NE含量比較 模型組和激素組第14、28天血清NE含量較正常對(duì)照組顯著增高(P均＜0．01);治療組第14、28天血清 NE含量較模型組和激素組顯著降低(P均＜0．01)，詳見表1。

表1 各組大鼠血清NE含量比較［ρ/(μg·mL)±s］

表1 各組大鼠血清NE含量比較［ρ/(μg·mL)±s］

注:與正常對(duì)照組相比，*P＜0．01;與模型組和激素組相比，△P＜0．01

組別 n NE 14 d 28 d模型組 10 12．91 ±2．78* 17．09 ±6．99*10 3．98 ±1．34 4．60 ±2．67激素組 10 12．66 ±2．95* 20．57 ±4．74*治療組 10 3．88±2．01△ 3．01±1．65△正常對(duì)照組

3 討論

ALI是全身失控性炎癥反應(yīng)的肺部表現(xiàn)，其中激活的PMN在肺內(nèi)聚集是導(dǎo)致肺損傷發(fā)生、發(fā)展的重要步驟［2，3］。肺間質(zhì)纖維化的病理特征是大量活化的PMN在肺血管和問質(zhì)聚集，活化的PMN釋放NE和氧自由基［2］，而NE可通過水解肺彈性蛋白、蛋白多糖和膠原直接損傷肺血管內(nèi)皮細(xì)胞和血管基底膜，并有可能是全身炎癥反應(yīng)綜合征(Systemic inflammatory response syndrome，SIRS)時(shí)各種原因?qū)е路伍g質(zhì)纖維化的共同通路［1，4］。NE 由 PMN 合成、儲(chǔ)存和釋放，又可反饋性調(diào)控PMN的生成、游走和浸潤(rùn)，兩者之間形成負(fù)反饋調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)［5］。NE是一種蛋白溶解酶，作用底物十分廣泛，包括細(xì)胞外基質(zhì)成分和多種可溶性蛋白［4，6］。NE的最適底物是彈性蛋白，彈性蛋白被分解時(shí)，上皮及內(nèi)皮細(xì)胞間的緊密連接被破壞，毛細(xì)血管通透性增加，大量血漿成分和活性物質(zhì)滲透至肺間質(zhì)，使肺水腫形成［4，6］。NE還可誘導(dǎo)細(xì)胞因子粒細(xì)胞—巨噬細(xì)胞集落刺激因子 (GM-CSF)、IL-6、IL-8等的表達(dá)，趨化并激活更多的PMN［7］，使肺部炎癥反應(yīng)和肺損傷不斷放大。

目前研究認(rèn)為，NE在ALI成人呼吸窘迫綜合征(ALIYARDS)發(fā)病中起著十分關(guān)鍵的作用［8］，減少NE釋放和降低NE活性是藥物治療ALI的有效途徑。有研究表明使用蛋白酶抑制劑可明顯降低NE活性，減輕缺血/再灌注后肺損傷［9］。肺通口服液是以益氣養(yǎng)陰、清熱化痰、止咳化痰為治則，由黃芪、黨參、麥冬、沙參、當(dāng)歸等組方的中成藥物。本研究顯示，正常對(duì)照組雙肺外觀無異常，HE、VG染色所示肺組織學(xué)形態(tài)亦正常，模型組肺組織均出現(xiàn)出血及壞死(提示制模成功)，激素組肺泡炎和肺間質(zhì)纖維化程度與模型組相似，治療組肺泡炎和肺間質(zhì)纖維化程度與激素組和模型組相比顯著減輕;治療組第14、28天血清NE含量較模型組和激素組顯著降低。提示肺通口服液能減輕內(nèi)毒素所致肺間質(zhì)纖維化大鼠的肺組織損傷，機(jī)制可能與其降低血清中NE表達(dá)、降低肺泡毛細(xì)血管通透性、減輕肺水腫有關(guān)。

綜上所述，肺通口服液能減輕ALI大鼠的肺泡炎和肺間質(zhì)纖維化程度，可能機(jī)制是通過減少血清NE釋放降低肺泡毛細(xì)血管通透性、減輕肺水腫。

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