桉葉油對體外培養人絨毛膜細胞增殖的影響

向 濤，李小燕，余永莉，程 秦，許本宏，張亞玲，李嘯紅

(1珠海市金灣區計劃生育服務站，廣東珠海519041;2遵義醫學院珠海校區)

桉樹在我國西南部和南部種植廣泛、資源豐富，是民間常用的中草藥。桉葉油(Eucalyptus)是自桉葉中提取的具有揮發性的物質，主要化學成分是萜類、萜醇、醚、酮類和酯等含氧化合物，其藥理作用包括抗菌［1～3］、抗氧化［4～7］、抗炎［8，9］、促滲［10，11］、殺蟲驅蚊［12～15］及防腐。研究顯示，無明顯細胞毒性作用劑量的桉葉油可影響乳腺癌細胞株MCF-7細胞孕激素受體表達，但其機理文獻鮮見相關報道。本研究觀察了桉葉油對體外培養人絨毛膜細胞增殖的影響，旨在為其在食品添加及藥品開發中的應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1．1 材料 健康婦女孕6～8周新鮮人工流產的絨毛組織，實驗時用0．25%胰酶消化，200目篩網過濾后離心收集細胞，加入適量含有20%小牛血清的DMEM培養液備用;桉葉油(桉葉素99．5%)購自德信行(珠海)香精香料有限公司，批號H071126。

1．2 人絨毛膜細胞分組及處理 取上述人絨毛膜細胞隨機分為對照組和桉葉油組，均用含有20%小牛血清的DMEM培養液稀釋后接種于細胞培養板，其中桉葉油組加入不同質量濃度的桉葉油，使終質量濃度分別為 0．75、0．15、0．015、0．001 5 mg/mL;對照組加入70%乙醇10μL/mL。

1．3 人絨毛膜細胞增殖情況測定 采用臺盼藍染色，每12 h計數一次活細胞，連續計數48 h，繪制細胞生長曲線;桉葉油處理后12、24、36 h以MTT法測定細胞增殖抑制率，12、24 h時同時以流式細胞儀測定細胞周期和凋亡情況。

1．4 統計學方法 采用SPSS15．0統計軟件。計量數據以±s表示，兩均數比較行t檢驗。P≤0．05為差異具有統計學意義。

2 結果

2．1 桉葉油對人絨毛膜游離細胞生長的影響 隨培養時間延長，兩組人絨毛膜細胞數量均逐漸減少，其中0．75 mg/mL桉葉油組人絨毛膜細胞生長明顯受抑，與對照組相比P＜0．05;其余桉葉油各組對絨毛膜細胞生長的影響與對照組相比，P＞0．05(見圖1)。

圖1 桉葉油對人絨毛膜細胞生長的影響

2．2 桉葉油對人絨毛膜細胞的增殖抑制效應0．75 mg/mL桉葉油組人絨毛膜細胞增殖抑制率與對照組相比 P ＜ 0．05;0．15、0．015、0．001 5 mg/mL桉葉油組人絨毛膜細胞增殖抑制率與對照組相比P＞0．05。詳見表 1。

表1 兩組人絨毛膜細胞增殖抑制率比較(%±s)

表1 兩組人絨毛膜細胞增殖抑制率比較(%±s)

注:與同時間對照組比較，*P＜0．05

組別 細胞增殖抑制率12 h 24 h 36 h桉葉油組0．0015 mg/mL 4．31 ±11．51 －5．83 ±10．58 4．73 ± 8．31 0．015 mg/mL －2．99 ±10．10 －7．06 ± 9．64 4．41 ± 8．00 0．15 mg/mL 9．15 ±14．61 10．42 ±11．38 7．10 ±11．10 0．75 mg/mL 53．49 ±11．89* 78．50 ±18．43*95．55 ± 3．54*對照組8．65 ± 3．24 7．33 ± 7．21 6．24 ± 4．35

2．3 桉葉油對人絨毛膜細胞周期及凋亡率的影響

桉葉油作用12 h后，0．75 mg/mL桉葉油組G0～G1期細胞減少、S期細胞增多、G2～M期細胞減少、凋亡率明顯增高，與對照組相比，P＜0．05;0．15、0．015、0．001 5 mg/mL 桉葉油組 G0～G1期、G2～M期細胞比例與對照組相比P＜0．05，S期細胞比例及凋亡率與對照組相比P＞0．05(詳見表2)。桉葉油作用24 h后，0．75 mg/mL桉葉油組G0～G1期細胞比例減少、S期細胞比例減少、G2～M期細胞比例增多、凋亡率升高，與對照組相比P＜0．05;與對照組相比，0．15、0．015、0．001 5 mg/mL 桉葉油組 S 期細胞比例均顯著升高(P均＜0．05)，G2～M期細胞比例及凋亡率均無明顯變化(P均＞0．05)，詳見表3。

表2 實驗12 h兩組人絨毛膜細胞的細胞周期及凋亡率比較(%ˉ ±s)

表2 實驗12 h兩組人絨毛膜細胞的細胞周期及凋亡率比較(%ˉ ±s)

注:與對照組比較，*P ＜0．05

組別 G0～G1 S G2～M 凋亡率桉葉油組0．001 5 mg/mL 55．23 ±1．84* 31．64 ±4．19 8．09 ±2．94* 26．71 ±5．61 0．015 mg/mL 57．32 ±1．58* 27．26 ±0．83 15．96 ±1．86* 26．70 ±1．65 0．15 mg/mL 49．23 ±1．95* 27．19 ±2．18 23．44 ±2．83* 23．27 ±1．07 0．75 mg/mL 19．79 ±1．52* 63．58 ±1．66*16．50 ±1．84* 33．60 ±1．74*對照組 41．28 ±1．48 29．52 ±1．97 28．99 ±1．92 25．43 ±1．94

表3 實驗24 h兩組人絨毛膜細胞的細胞周期及凋亡率比較(% ±s)

表3 實驗24 h兩組人絨毛膜細胞的細胞周期及凋亡率比較(% ±s)

注:與對照組比較，*P ＜0．05

組別 G0～G1 S G2～M 凋亡率桉葉油組0．001 5 mg/mL29．32 ±11．06* 50．70 ±2．46* 30．92 ±1．16 17．59 ±1．36 0．015 mg/mL 43．43 ±1．11* 38．73 ±2．05* 22．97 ±3．84 17．80 ±2．47 0．15 mg/mL 30．73 ±4．01* 38．09 ±2．18* 31．24 ±1．04 13．63 ±1．59 0．75 mg/mL 23．39 ±2．16* 28．77 ±1．54* 47．50 ±2．35* 57．14 ±2．28*對照組 58．48 ±1．43 13．08 ±1．99 28．57 ±0．92 13．45 ±2．36

3 討論

目前，桉葉油已成為醫藥、香料和化學工業的重要原料及常用食品添加劑，尤其廣泛用于皮膚用藥制劑中。但我們的前期研究發現，桉葉油400 mg/kg對小鼠無遺傳毒性，可降低環磷酰胺誘發的小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核率和精子畸形率;300 mg/kg的桉葉油對大鼠無胚胎毒性，對環磷酰胺誘發的胚胎畸形有拮抗作用，對孕鼠血清雌孕激素水平有一定影響［16］。

在胚胎發育過程中，絨毛膜細胞的生長狀況和分泌活動起至關重要的作用。為進一步探討上述現象發生的機制，本研究觀察了桉葉油對體外培養的人絨毛膜細胞增殖的影響。結果顯示:①隨培養時間延長，兩組人絨毛膜細胞數量均逐漸減少，其中0．75 mg/mL桉葉油組人絨毛膜細胞生長明顯受抑，與對照組相比有顯著差異;其余桉葉油各組絨毛膜細胞生長情況與對照組相比無顯著差異。②0．75 mg/mL桉葉油組人絨毛膜細胞增殖抑制率顯著高于對照組，其余桉葉油各組人絨毛膜細胞增殖抑制率與對照組相比無顯著差異。③桉葉油作用12 h后，0．75 mg/mL桉葉油組G0～G1期細胞減少、S期細胞增多、G2～M期細胞減少、凋亡率明顯增高，與對照組相比有顯著差異;其余桉葉油各組G0～G1期、G2～M期細胞比例與對照組相比有顯著差異，S期細胞比例及凋亡率無顯著差異。桉葉油作用24 h后，與對照組相比，0．75 mg/mL桉葉油組G0～G1期細胞比例減少、S期細胞比例減少、G2～M期細胞比例增多、凋亡率升高;其余桉葉油各組S期細胞比例均顯著升高，G2～M期細胞比例及凋亡率均無明顯變化。提示0．75 mg/mL桉葉油對絨毛膜細胞生長有明顯抑制作用和細胞毒作用，可顯著影響絨毛膜細胞周期、誘導絨毛膜細胞凋亡;而 0．15、0．015、0．001 5 mg/mL桉葉油對絨毛膜細胞生長無明顯抑制作用和細胞毒作用，也無誘導絨毛膜細胞凋亡的作用，但對絨毛膜細胞的細胞周期有影響。上述結果證實，美國食品香料制造協會(FEMA)規定的桉葉油在食品中的最高參考量劑量范圍是安全的;無毒副作用劑量范圍內桉葉油對絨毛膜細胞的生長有影響，此影響可能是通過影響細胞周期來實現，但影響細胞周期的具體機理及對絨毛膜細胞的分泌功能有無影響均有待進一步研究。

綜上所述，質量濃度≤0．15 mg/mL的桉葉油對人絨毛膜細胞無明顯生長抑制、細胞毒性及誘導細胞凋亡的作用，但可影響細胞周期，且此影響可能隨作用時間不同而異;此為桉葉油在食品添加及藥物開發中的應用提供了實驗依據。

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