醛糖還原酶5’端兩種基因多態性與2型糖尿病腎病的相關性研究

李 艷劉長山* 程 碩

（1 濰坊醫學院，山東 濰坊 261041；2 濰坊市人民醫院，山東 濰坊 261041）

醛糖還原酶5’端兩種基因多態性與2型糖尿病腎病的相關性研究

李 艷1劉長山2* 程 碩1

（1 濰坊醫學院，山東 濰坊 261041；2 濰坊市人民醫院，山東 濰坊 261041）

目的 探討醛糖還原酶（AR）基因啟動子區 C（-106）T 單核苷酸多態性和 2.1Kb 處（AC）n 二核苷酸微衛星多態性與 2 型糖尿病腎病（DN）的關系。方法 用聚合酶鏈反應（PCR）、測序及瓊脂糖凝膠電泳技術檢測 AR 基因兩多態位點的基因型及等位基因，比較各組分布頻率。結果 在 DM 組和 CON 組均發現 AR 基因 C（-106）T 多態位點存在 C、T 兩種等位基因和 CC、CT、TT 三種基因型，(AC)n序列的 7 種等位基因（Z-6～Z+6）；T、Z-2 等位基因及 CT+TT 及含有 Z-2 的基因型在 DN 組明顯高于 NDN 和 CON 組，但在 DM 組和CON 組之間無顯著性差異。結論 AR 基因 C（-106）T 多態位點的 T 等位基因及 (AC)n 多態位點的 Z-2 等位基因可能是 DN 的易感基因。

2型糖尿?。蝗┨沁€原酶；糖尿病腎?。贿z傳

糖尿病腎病（DN）是糖尿?。―M）常見的慢性微血管并發癥之一，為終未期腎衰竭的主要病因，也是DM患者致死、致殘的主要原因。遺傳因素在DN的發生和發展中起重要作用。醛糖還原酶（AR）是多元醇通路的限速酶，該基因表達異常或酶活性升高將促進糖尿病微血管并發癥的發生、發展。但編碼該酶的基因變異與DN的相關性報道不一[1-3]。本研究旨在探討山東地區漢族人群中AR基因5’端的C（-106）T和（AC）n多態性與DN易感性的關系。

1 對象與方法

1.1 對象

2型糖尿?。―M）組：按1999年WHO糖尿病診斷標準，選自2011年3月至2012年9月我院內分泌科住院的2型糖尿病患者192例，均為山東漢族人，彼此無血緣關系，所有患者病程均超過10年。并排除其他各種急慢性疾病。根據尿微量白蛋白排泄率（UAER）分為兩亞組：①DN組：共98例，男50例，女48例，年齡49～80歲，平均（64.92±8.49）歲，病程為（14.1±3.8）年。入選標準為6個月內連續3次測定UAER≥20μg/min，并排除由心、肝和其他全身疾病或原發泌尿系統疾病及應用影響腎功能藥物引起微量白蛋白尿者。②NDN組：共94例，男44例，女50例，年齡46～79歲，平均（63.86 ±7.98）歲，病程為（12.4±3.6）年，6個月內連續3次測UAER＜20μg/min。正常對照（CON）組：選自我院健康查體者101例，口服75g葡萄糖耐量試驗正常，男61例，女40例，年齡40～70歲，平均（60.67±7.68）歲。

1.2 方法

①生化指標檢測：高壓液相法測糖化血紅蛋白（HbA1C）、UAER，葡萄糖氧化酶法測血糖。②基因組DNA提?。河肧olarbio全血基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）從外周血白細胞中提取DNA，紫外分光光度計測量DNA的濃度，于-20℃保存。③聚合酶鏈反應（PCR）：C（-106）T引物序列參照文獻[4]。（AC）n引物序列參照文獻[2]。均由上海生工生物工程有限公司合成（PAGE純化，純度≥99%）。PCR總反應體系25μL，含DNA、引物各1.0μL、10× Buffer2.5μL、dNTP、Taq DNA聚合酶0.25μL、滅菌三蒸水19μL。參數為：94℃5min，94℃30s，66℃30s，72℃1min，共32個循環，最后于72℃終止10min，4℃保存。PCR產物行2%瓊脂糖凝膠電泳，通過凝膠成像系統觀察并攝片。④PCR擴增產物測序：將擴增產物DNA樣本送至上海生工生物工程有限公司進行純化及測序，根據測序結果確定AR基因的等位基因及基因型。

1.3 統計學方法

正態分布臨床資料用均數±標準差（χ—±s）表示，組間比較用t檢驗。各組間基因型和等位基因頻率比較用χ2檢驗。α=0.05。數據處理采用SPSS17.0統計軟件完成。

2 結 果

2.1 一般檢測結果

表1示DN組病程、MBP、FPG、HbA1C、UAER均高于其余2組，有顯著性差異，其余指標在各組間無顯著性差異。

2.2 C（-106）T基因多態性檢測結果 根據測序結果與AR基因序列進行比對，觀察-106位點基因測序結果及對應測序曲線，-106位點單峰表示CC/TT基因型（圖1），套峰表示CT基因型。AR基因C（-106）T等位基因及基因型分布頻率在DM與CON組差異無統計學意義（χ2=0.029，P = 0.868；χ2=0.068，P =0.985）；TT+CT基因型頻率在DN組顯著高于NDN組（χ2=12.65，P=0.003）；T等位基因頻率在DN組顯著高于NDN組（χ2=11.01，P =0.004），見表2。

表1 各組一般情況及臨床資料比較（χ—±s）

圖1 -106位點單峰表示CC/TT基因型

表2 AR基因C(-106)T多態基因型及等位基因分布頻率[例(%)]

2.3 （AC）n雙核苷酸多態性檢測結果

將最常見的等位基因命名為Z，其純合子樣本DNA測序結果為（AC）24，與國外所用命名一致。按（AC）n的重復數n 21～27，依次命名為Z-6、Z-4、Z-2、Z、Z+2、Z+4、Z+6（圖2）。DN組Z-2等位基因頻率高于NDN和CON組（χ2=13.08、10.62，P＜0.01），DN組含Z-2等位基因的基因型頻率高于NDN和CON組（χ2=11.22、12.31，P＜0.01），差異均有顯著意義。等位基因及基因型分布頻率在DM與CON組差異無統計學意義（χ2=0.832，P=0.920；χ2=0.361，P=0.912）。

2.4 兩種多態位點聯合的分布頻率比較

將攜帶C（-106）T多態位點C、T等位基因和（AC）n多態位點Z-2、X等位基因的基因型與糖尿病腎病相分析，發現Z-2/C、Z-2/T、X/ T基因型在DN組均高于NDN組（χ2=11.08、14.65、10.97，P＜0.01）；X/C基因型在DN組低于NDN組（χ2=46.32，P＜0.01）。見表3。

3 討 論

圖2 命名

表3 AR基因（AC）n/C（-106）T在各組中的分布頻率[例（%）]

AR是多元醇通路的關鍵酶，催化NADPH依賴的醛糖轉化為相應的醇。AR對葡萄糖的親和力較低，但在高糖條件下可能被激活。AR作為潛在的候選基因產物參與糖尿病慢性并發癥的發病機制也因此引起了研究人員的極大興趣，并受到廣泛關注[5]。目前的研究表明，AR啟動子區C（-106）T單核苷酸多態性和轉錄起止點上游-2.1kb處的（AC）n微衛星多態性與糖尿病腎病的發病可能相關，但呈現出一定的地區和民族差異[2]。本研究顯示，山東地區漢族人群中也存在該多態性，DN組Z-2、T等位基因頻率及含Z-2、T等位基因的基因型頻率顯著高于NDN組和CON組，提示AR基因的Z-2和T等位基因可能是DN的易感因素。由于這兩個多態位點距離較近，是否存在連鎖不平衡尚不得而知。糖尿病腎病是多基因遺傳病，與環境和遺傳等多種因素有關，發病機制尚不明確，有待于進一步加大樣本進行多種族、多地區的研究。

[1]Katakami N,Kaneto H,Takahara M,et al.Aldose reductase C(-106) T gene polymorphism is associated with diabetic retinopathy in Japanese patients with type 2 diabetes[J].Diabetes Res Clin Pract, 2011,92(3):57-60.

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The Relationship between the Two Polymorphisms at the 5’-end of the Aldose Reductase Gene and Diabetic Nephropathy

LI Yan1, LIU Chang-shan2*, CHENG Shuo1
(1 Weifang Medical University, Weifang 261041, China; 2 Weifang People's Hospital, Weifang 261041, China)

ObjectiveTo investigate the relationship of aldose reductase gene promoter area C(-106)T single nucleotide polymorphism and 2.1 Kb place (AC)n dinucleotide microsatellite polymorphism and type 2 diabetes nephropathy.MethodsUsing polymerase chain reaction（PCR), sequencing and agarose gel electrophoresis technology detection AR gene genotype and allele, compare the frequency distribution.ResultT, Z-2 allele and CT+TT, Z-2 genotype in DN group is obviously higher than that of the NDN and CON group, but in DM group and CON no significant differences.ConclusionBoth the T allele of C(-106)T polymorphism and the Z-2 allele of (AC)n polymorphism at AR gene may be susceptibility genes of DN.

Type 2 diabetes; Aldose reductase; Diabetic nephropathy; Genetic

R587.2

：B

：1671-8194（2013）06-0005-02

*通訊作者