BrdU免疫熒光染色方法的改進

楊 燕嚴小新李 明鄧思浩薛志琴李志遠*

（1 中南大學基礎醫學院人體解剖學與神經生物學系，湖南 長沙 410013；2 湘潭職業技術學院，湖南 湘潭 411100；3 長治醫學院人體解剖學教研室，山西 長治 046000）

BrdU免疫熒光染色方法的改進

楊 燕1,2嚴小新1李 明3鄧思浩1薛志琴1李志遠1*

（1 中南大學基礎醫學院人體解剖學與神經生物學系，湖南 長沙 410013；2 湘潭職業技術學院，湖南 湘潭 411100；3 長治醫學院人體解剖學教研室，山西 長治 046000）

目的 探索一種能確保 BrdU 與其他標志物免疫熒光染色順利進行的方法。方法 本實驗采用三種不同的過酸方法來進行 BrdU 免疫熒光染色：即①傳統染色法；②過酸提前法；③室溫過酸法。采集圖像，觀察三種方法的實驗結果并統計實驗數據。結果 ①傳統染色法：BrdU 陽性標記定位明確，與之雙標的標志物 DCX 亦可正常顯色，但核酸染料 bisbenzimide 卻未能正常顯色；②染色提前法：BrdU與 DCX 均可正常顯色，而 bisbenzimide 顯色不穩定；③室溫過酸法：BrdU 與 DCX、bisbenzimide 均能正常顯色，且熒光亮度適中，效果理想。結論 室溫過酸法能確保 BrdU 與其他標志物雙標正常顯色，同時又能保證用來明確 BrdU 處理過的活細胞增殖狀態的 bisbenzimide染料正常顯色，是目前一種較好的能夠辨別 BrdU 假陽性的免疫熒光染色方法。

BrdU bisbenzimide；免疫熒光染色

5-溴-2-脫氧尿嘧啶核苷（5-bromo-2-deoxyuridine，BrdU）為胸腺嘧啶脫氧核苷類似物，在細胞周期的S期DNA合成過程中整合到細胞核內，只要細胞不凋亡，BrdU將永久地存留在細胞核DNA中，并能通過免疫組織化學方法檢測到，可用于標記BrdU暴露期間進行DNA合成的細胞，故BrdU是反應在體腦神經干細胞增殖能力的一個非常可靠的標志物，目前廣泛應用于神經再生領域的研究[1,2]。

圖1 傳統染色法免疫熒光染色[傳統染色法：BrdU（紅色）、DCX（綠色）和bisbenzimide（藍色）免疫熒光染色。可見BrdU（A，→）和DCX（B，→）陽性細胞，但未見bisbenzimide（C）陽性細胞，只可見BrdU和DCX雙標結果（D）(40×10)]

圖2 過酸提前法免疫熒光染色[過酸提前法：BrdU（紅色）、DCX（綠色）和bisbenzimide（藍色）免疫熒光染色。可見BrdU（A）、DCX（B）陽性細胞，也可見bisbenzimide（C）陽性細胞，但熒光亮度偏暗，且不穩定，同時可見BrdU、DCX和bisbenzimide三標結果（D）(40×10)]

圖3 室溫過酸法免疫熒光染色[室溫過酸法：BrdU（紅色）、DCX（綠色）和bisbenzimide（藍色）免疫熒光染色。可見BrdU（A）、DCX（B）陽性細胞，也可見bisbenzimide（C）陽性細胞，且熒光亮度適中，結果穩定，同時可見BrdU、DCX和bisbenzimide三標結果（D，→），能見到BrdU和bisbenzimide的熒光淬滅現象(40×10)]

二聯苯亞胺（bisbenzimide）是一種體外活性的與DNA小溝（minor groove）結合的染料，作為核酸染料，它可通過細胞膜與DNA結合，并可被紫外光及大多數熒光光源激發，比較適用于與其他紫外光激發的熒光染料一起作多重熒光標記，目前已被廣泛應用[3]。這類染料中的Hoechst 33342在BrdU插入DNA的位點上發生熒光淬滅現象，因此可用來確定BrdU處理過的活細胞的增殖狀態，對于BrdU免疫熒光染色假陽性的現象具有很好的鑒別作用。

1 材料與方法

1.1 試劑和實驗動物

試劑：BrdU （B5002，Sigma-Aldrich，St Louis，MO）、BrdU單克隆抗體rat anti-BrdU （Serotec，MCA2060，1∶4000）、DCX單克隆抗體goat anti-DCX（Santa Cruz Biotech，sc-8066，diluted at 1∶2000）、熒光二抗Alexa-Fluor? 488 and Alexa-Fluor? 594 donkey anti-goat and rat IgGs （Invitrogen，Carlsbad，CA，1∶400）、Bisbenzimide（hoechst 33342）。

實驗動物：成年豚鼠，雌雄不限，體質量200～250g，購自中南大學實驗動物部。

1.2 BrdU標記

豚鼠腹腔注射BrdU，50mg/kg，注射2次，每次間隔時間為12h。繼續飼養7d，處死。此時BrdU參與合成的DNA多表達見于未成熟神經元，如DCX細胞[4]。

1.3 取材和標本處理

實驗動物用10%水合氯醛（0.4mL/kg）麻醉，用4%多聚甲醛灌注后取腦，并將其浸泡在相同固定液中進行后固定，置于4℃冰箱中48h。梯度蔗糖沉糖處理，從前囟后3.5～5.0mm作連續冰凍切片，厚度為6μm，貼于陽離子玻片，取24張海馬齒狀回和大腦皮層結構結構完整的腦片，并確保每張腦片觀察部位大體接近，用于BrdU免疫熒光染色。

1.4 免疫熒光染色

將24張貼好的腦片隨機分為3組，采用以下3種不同的免疫熒光染色方法進行染色。

1.4.1 傳統染色法

將腦片先置于formamide（甲酰胺）與SSC（枸櫞酸鈉，PH6.0）按照1∶1配好的試劑中，在65℃水浴鍋進行抗原修復1h，自然冷卻至室溫并清洗，然后置于2N鹽酸，37℃水浴鍋中30min，使核變性，自然冷卻并清洗，再經0.01mol/L Tris-HCL 10min，清洗后用5%驢血清封閉2h，加一抗BrdU與DCX行BrdU與DCX免疫熒光雙標實驗，一抗為rat anti-BrdU和goat anti-DCX，濃度分別為1∶4000和1∶2000。4℃冰箱中孵育18h，復溫、清洗。加熒光二抗Alexa-Fluor? 488 and Alexa-Fluor? 594 donkey anti-goat and rat IgGs，濃度均為1∶400，孵育2h后清洗，加bisbenzimide（hoechst 33342）濃度為1∶50000，10min后清洗，50%甘油封片。

2N鹽酸使DNA雙鏈變性解開，Tris-HCL重建免疫組化所需的堿性環境，這樣可以很好地暴露存在于DNA雙鏈中的抗原，達到充分暴露BrdU的目的[5]。

1.4.2 過酸提前法

將腦片置于formamide（甲酰胺）與SSC（枸櫞酸鈉，PH6.0）按照1∶1配好的試劑中，在65℃水浴鍋進行抗原修復1h，自然冷卻至室溫并清洗后，放入bisbenzimide（hoechst 33342）濃度為1∶50000，10min，然后置于2N鹽酸，37℃水浴鍋中30min，其后方法同1.4.1但由于bisbenzimide見光分解，故要求實驗全程避光。

1.4.3 室溫過酸法

實驗步驟同傳統染色法，但過2N鹽酸時，將實驗環境從37℃水浴鍋調整為室溫（26～28℃）即可。

1.5 圖像采集

每張免疫熒光雙標染色的切片均采用Olympus Fluoview 熒光顯微鏡在40倍鏡下定位皮質、海馬攝片。

1.6 統計學方法

采用SPSS16.0進行統計學分析，各組bisbenzimide表達情況的比較采用卡方檢驗。

2 結 果

采用不同的過酸方法進行BrdU的免疫熒光染色，各組的bisbenzimide表達情況見表1，傳統染色法進行免疫熒光染色，BrdU陽性標記定位明確，與之雙標的標志物DCX亦可正常顯色，但核酸染料，用來明確BrdU處理過的活細胞增殖狀態的bisbenzimide卻未能正常顯色（圖1A、B、C、D）。

過酸提前法結果顯示，BrdU陽性標記定位明確，與之雙標的標志物DCX亦可正常顯色，而bisbenzimide顯色不穩定，在所做的8例切片中，僅3例有顯色，且熒光亮度偏暗，其余均無顯色（圖2A、B、C、D）。

室溫過酸法結果顯示，BrdU陽性標記定位明確，與之雙標的標志物DCX亦可正常顯色，bisbenzimide也能正常顯色。在所做的8例切片中，均有著色，且熒光亮度適中，效果理想（圖3A、B、C、D）。

表1 不同過酸方法bisbenzimide表達情況的比較

3 討 論

神經干細胞在20世紀末被發現以后，已逐漸成為神經科學研究的熱點之一。BrdU作為一種常用的外源性細胞增殖標志物，方便、簡單、可靠。由于BrdU是胸腺嘧啶脫氧核苷類似物，它作為DNA合成的原料摻入到細胞中，處于S期（DNA合成期）的細胞。當有BrdU存在時，摻入到新合成的雙鏈DNA內，以氫鏈與腺嘌呤（A）結合，有實驗表明，只要有0.5%的胸腺嘧啶 被 BrdU 取 代 ， 就 能 用 免 疫 組 織 化 學 方 法 檢 測 出 來[6]。 然 而 由于BrdU這個抗原處于DNA雙鏈內，使得該指標的檢測具有特殊性，如果DNA雙鏈內的抗原不處理，或處理不當，將影響實驗 結 果[7]。 因 此 在 選 擇 實 驗 方 法 時 均 需 要 通 過 抗 原 修 復[8]， 同 時過鹽酸使核變性，再經過Tris-HCL重建免疫組化所需的堿性環境，充分暴露BrdU。但在實驗過程中，傳統方法對于免疫組織化學DAB染色沒有任何影響，但在免疫熒光染色中，卻發現經37℃ 2N鹽酸處理后的切片雖有BrdU與其他雙標的顯色，卻不能很好地完成bisbenzimide的顯色。

Bisbenzimide是屬于核酸染料，它對于明確BrdU有重要意義，可以有效防止假陽性染色的出現。使用鹽酸的目的是促使核變性，因此使用鹽酸對于bisbenzimide顯色是有一定影響的，然而此步驟卻又是BrdU能夠成功顯色必不可少的一步。經過反復試驗，通過將bisbenzimide染色提前在鹽酸之前，雖有切片能出現bisbenzimide顯色，但該物質見光分解，將此步驟提前，距離實驗結束中間步驟較多，且間隔時間較遠，最終導致實驗結果的不穩定；而室溫下（26～28℃）過鹽酸是經過反復試驗驗證，真正能既保證BrdU與其他標志物雙標正常顯色，又能保持bisbenzimide正常顯色的最佳方法，這對于判斷BrdU是否存在假陽性，確保實驗結果最終的可性度具有非常重要的意義。

[1]Higuchi Y,Hattori H,Kume T,et al.Increase in nitric oxide in the hypoxic-ischemic neonatal rat brain and suppression by 7-nitroindazo-le and aminoguanidine[J].Eur J Pharmacol,1998,342(1): 47-49.

[2]Seaberg RM,van der Kooy D.Adult rodent neurogenic regions: the ventricular subependyma contains neural stem cells ,but the dentate gyrus contains restricted progenitors [J].J Neurosci,2002, 22(5):1784-1793.

[3]Schnell SA,Wessendorf MW.Bisbenzimide: a fluorescent counterstain for tissue autoradiography[J].Histochemistry,1995,103(2): 111-114.

[4]Brown,JP,Couillard-Despres S,Cooper-Kuhn CM,et al.Transient expression ofdoublecortin during adult neurogenesis[J].J Comp Neurol,467(1):1-10.

[5]Shimada A,Shibata T,Komatsu K,et al.Improved methods for immunohistochemical detection of BrdU in hard tissue[J].J Immunol Methods,2008,339(1) : 11-16.

[6] 陳志宏,倪道鳳、高揚等.流感病毒感染后小鼠嗅覺神經元的凋亡與再生[J].中國耳鼻喉顱底外科雜志,2004,10(6) : 324-326.

[7]Mathonnet M,Lalloue F,Pettit B,et al.Differential response of olfactory neurons to axotomy at embryonic and postnatal stages [J].Neuroscience,2002,109(2) : 207-217.

[8] 王伯沄.病理學技術[M].北京:人民衛生出版社,2001: 368.

R446.6

：B

：1671-8194（2013）06-0060-03

*通訊作者：E-mail：li_zhiyuan@gibh.ac.cn