大黃中有效成分的提取、分離測定及其抗突變作用

劉蓓蓓

（青海普蘭特藥業有限公司，青海 西寧 810007）

大黃中有效成分的提取、分離測定及其抗突變作用

劉蓓蓓

（青海普蘭特藥業有限公司，青海 西寧 810007）

隨著國民經濟水平不斷的提高，天然中草藥的研究與利用成為了一種新的潮流。大黃作為一種常用中藥，其有效成分的提取、分離測定以及抗突變作用引起了人們的廣泛關注。為此，我們開展了對大黃有效成分提取、分離測定以及抗突變作用的研究工作。

大黃；大黃酸；大黃甲醚；大黃素

大黃作為一種常用的中藥，是種非常重要的出口商品，它具有抗菌、抗病毒、利水通淋、舒肝利膽、抗腫瘤、消炎、止血、止吐等多方面的功效。近幾年來，大黃作用的研究越來越多的引起了學者的關注。

1 大黃的簡介

大黃是多種蓼科大黃屬的多年生植物的合稱，也是中藥材的名稱，主要有掌葉大黃、唐古特大黃、藥用大黃和食用大黃得分別。它的主要活性成分是蒽類衍生物，主要包括大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚、蘆薈大黃素和土大黃素等有效成分，除此還含有許多化合物、有機化合物和無機物。

2 大黃有效成分提取的實驗

2.1 實驗材料

土大黃苷、蒸餾水、甲醇、乙醚、氯仿、無水硫酸鈉以及十八烷基硅烷鍵合硅膠等。

2.2 實驗儀器

三口燒瓶、回流冷凝管、LC-10A高效液相色譜儀、分子篩、燒杯、玻璃棒、試管、量筒、膠頭滴管、坩堝、坩堝鉗、研缽、蒸發皿、藥匙、濾紙、pH試紙、分析天平、稱量瓶及電熱爐。

2.3 實驗目的

了解以大黃為代表的中醫藥有效提取的基本方法，進一步掌握大黃有效成分提取、分離測定以及抗突變的作用。

2.4 實驗原理

土大黃苷經過甲醇浸泡以后，大黃酚、大黃素等有機物會溶解于甲醇中，制成待測液以后，由于它們之間的相互作用是不同的，可以使用高效液相色譜法來進一步進行各種有效成分的提取、測量。

2.5 實驗內容

2.5.1 鑒別

本品橫切面：根木栓層以及皮層大多數已經去除。韌皮部非常明顯；薄壁組織十分發達。形成層成環狀。木質部射線較密，寬2～4列細胞，內含棕色物質；導管非木化，常1至數個相聚，稀疏排列。薄壁細胞含有草酸鈣簇晶，并含有多數淀粉粒。根莖的髓部寬大，在其中可以常見黏液腔，內有紅棕色物質；木質的部位于形成層的外方，粉末呈現黃棕色。取粉末少量，進行微量升華，我們可以看到菱狀針晶或者羽狀結晶。①取本品粉末0.1g，然后取甲醇20mL浸漬其中1h，過濾后，取濾液5mL，蒸干以后加水10mL使溶解。②加鹽酸1mL，置于水浴上加熱30min，立即冷卻后，用乙醚2次提取，每次20mL，合并乙醚液，蒸干后，殘渣加氯仿1mL使溶解，作為供試品溶液。③另外取大黃對照藥材0.1g，同法制成對照藥材溶液。④取大黃酸對照品，加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作為對照溶液。⑤依據薄層色譜法實驗，吸取了這三種溶液各4mL，分別點于同一種以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠H薄層板上，以30～60℃的石油醚-甲酸乙酯-甲酸的上層溶液為展開劑，展開，取出，然后晾干，放置紫外光燈下檢視。⑥在供試品色譜中，與對照藥材色譜相對應的位置上，顯示出了相同的5個橙黃色熒光主斑點；并且在和對照品色譜相應的位置上，顯示相同的橙黃色熒光斑點，放置在氨蒸汽中微熏后，在日光下檢視，會發現斑點變為紅色。圖1為分離提取的流程圖。

圖1 分離提取的流程圖

2.5.2 檢查

①取土大黃苷粉末0.2g，加甲醇2mL，溫浸10min后放置直至冷卻；②取上清液10mL，將其點于濾紙上，用45%乙醇展開，取出后晾干；③放置10min以后，放置紫外光燈下檢查，不得顯示持久的亮紫色熒光；④干燥失重，取本品不得過10%，酸不溶性灰分不得過0.8%。

值得注意的是：總灰分不得超過10.0%，酸不溶性灰分不得超過0.8%。

2.5.3 含量測定

對照品溶液的制備方法：①精確稱量大黃素、大黃酚對照品各5mg，分別放置在50mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻；②分別精確量取大黃素溶液1mL及大黃酚溶液2mL，分別放置在25mL量瓶中，加甲醇到達刻度，均勻搖動，可以得到。

供試品溶液的制備：①取本品粉末大約0.1g，然后取本品粉末的測定水分，精確稱量后放置在50mL錐形瓶中，精密加甲醇25mL，稱定重量；②加熱回流30min，放冷后，再稱定質量，用甲醇來補足減失的重量，搖勻后，過濾，精確量取續濾5mL，放置在50mL的圓底燒瓶中，將甲醇揮發；③加濃度為2.5mol/L的硫酸溶液10mL，超聲處理5min過后，加入氯仿10mL，加熱回流1h，冷卻后，放置在分液漏斗中，然后用少量氯仿洗滌容器，分取氯仿層，酸液用氯仿提取2次，每次約8mL，合并氯仿液，無水硫酸鈉脫水；④氯仿液放置在100mL錐形瓶中，將氯仿揮發，殘渣精密加甲醇10mL，稱其重量，放置于水浴中微熱溶解殘渣，放冷后，再稱定質量；⑤用甲醇填補減少的重量，均勻搖動，過濾，取續濾液，可得。⑥吸取這兩種對照品與供試品溶液各自5mL，注入液相色譜儀，測定得。

圖2 紙層析圖譜（1 煎煮法所得大黃溶液；2 1,8-羥基蒽醌對照溶液；3 超聲法提取的溶液）

圖3 大黃成分的液相色譜圖（A 煎煮提取液；B 超聲提取液）

2.5.4 炮制

①大黃：去除雜質，洗凈，潤透，切厚片或塊狀，晾干。②酒大黃：取凈大黃片，依照酒炙法炒干。③熟大黃：取凈大黃片，依照酒燉或酒蒸法燉或蒸直到內外都呈黑色。④大黃炭：取凈大黃片，依照炒炭法炒，直到表面焦黑色、內部焦色。

2.5.5 測定結果

按照干燥品計算，含有大黃素和大黃酚的總量應該不會少于0.05%，通過對大黃有效成分的提取、分離測定，我們了解了大黃的物理和化學性質，并且對大黃的藥理也有了新的認識。

3 大黃有效成分分離測定的主要方法

3.1 紙色譜法

我們可以用紙層法來研究蒽醌衍生物的紙上層析，但是由于紙色譜法分離效率是比較低的，所以已經逐漸被其他層析方法所替代，不是特別的常用。

3.2 柱色譜法

大黃酚和大黃素甲醚在結構上十分相似，極性上也存在許多相似的地方，所以用一般的層析方法很難分離。用柱層硅膠、石油醚作洗脫劑制備性來分離出大黃素甲醚和大黃酚，并且與纖維素柱層析進行了比較。當然也可以用硅膠H常壓柱、石油醚-乙酸乙酯作洗脫劑來高效的分離出大黃素甲醚和大黃酚。

3.3 薄層色譜法

薄層色譜法是在大黃的分離中一種十分常用的層析方法。把蒽醌甙元分離后就可以分別進行測定，還有薄層后要進行比色檢測、薄層后要在斑點顯色后進行光密度法、薄層后進行熒光檢測以及薄層后薄層掃描等。

3.4 高效液相色譜法

我們應用高速逆流色譜法可以成功的分離以及測定出大黃中大黃素、蘆薈大黃素、大黃素甲醚、大黃酸和大黃酚這五種蒽醌衍生物的含量。應用高效液相色譜法可以同時測定出大黃中蒽醌、蒽酮、蹂質等幾乎所有含酚羥基的成分。也可以用反相高效液相色譜法來檢測糖尿靈中成藥大黃酸的含量。下面我們用幾個簡單的表來說明高效液相色譜法，見表1～3。

紙層析圖譜和大黃成分的液相色譜圖見圖2、3。

表1 各因素及水平表

表2 L9（34）正交實驗直觀分析結果

表3 方差分析

3.5 高效毛細管電泳法

高效毛細管電泳法可以簡稱為HPCE，它是一種利用離子或者荷電粒子把電場作為驅動力而在毛細管中按照其淌度以及分配系數的不同來進行分離的一種新型電泳技術。使用毛細管電色譜法可以分離出大黃中的大黃素、蘆薈大黃素、大黃素甲醚和大黃酚這四種主要有效的成分，與高效液相色譜法比較，毛細管電泳不僅克服了分析時間長、分離效率低、色譜柱容易被污染等一些難以解決的問題，而且具備高效、迅速、溶劑消耗少、抗污染能力強等優點，因為高效毛細管電泳的這些優點，天然植物及中藥的分離分析應用它的范圍越來越寬了。

4 4 大黃的抗突變作用

大黃已經被廣泛的用于內外科婦女兒童傳染等臨床的急慢性疾病，像是治療內科高黏血綜合征、高血脂癥、卒中風、治療血癥以及幽門彎曲菌陽性的消化性潰腸、治高熱癥狀、便秘和單純性肥胖癥、外科創傷出血、急腹癥、術后腸麻痹等[1-3]。除此之外，大黃還具有抗腫瘤作用、增強免疫功能、抗衰老作用以及治療精神疾病等。在這些傳統病癥的治療中，關于大黃的藥理作用研究是非常全面、系統的。

近些年以來，大黃的抗突變作用逐步引起關注，但是由于研究系統的不完善，以及相關機制并不清楚。只是由大黃對環磷酰胺誘發的骨髓細胞染色體畸變有一定的抑制作用，所以推測出來大黃對于降低生命機體的脂質過氧化，能夠增強機體除掉自由基的能力，它保護了生物膜，這些都很有可能是大黃抗誘變作用的重要原因。但是大黃的藥用成分十分復雜，想要確定它準確的抗突變作用有效成分和它的機制還需要我們進行大量的研究工作，這就要我們在以后進行深入的探討及研究。

綜上所述，近幾年來純天然植物藥引起了人們的廣泛興趣，作為傳統中藥的一種，大黃逐漸成為研究的熱點話題。由于微波萃取技術的出現以及廣泛應用為中藥提取提供了一種新的方式，色譜、毛細管電泳理論的逐漸深入，非水毛細管電泳等新方法的逐步出現，這些都為中藥的分離、分析提供了越來越先進的技術，超臨界流體的引入更為中藥的提取和分離帶來了非常重要的變化。超臨界萃取和超臨界流體色譜技術都會在醫學領域上更多的應用到大黃乃至其他中藥的分析、分離中[4-6]。大黃的抗突變作用也正在逐漸引起重視，這樣不僅能夠擴大大黃的用途，并且對于大黃和其他中藥的開發具有深遠的影響。隨著科學技術的不斷提高，各種各樣的先進分析儀器也會逐步出現運用，這些都會加快中藥的現代化進程。

[1] 袁倬斌,尚小玉.大黃中有效成分的提取、分離測定及其抗突變作用[J].分析科學學報,2002,18(6):508-512.

[2] 茍奎斌,袁海龍,李仙義.超臨界流體萃取法用于大黃素的定量測定研究[J].中國醫藥學雜志,1999,34(9):145.

[3] 肖艷,杜智敏.大黃中有效成分提取分離條件的優化[J].中國臨床藥理學與治療學,2003,8(1):98-100.

[4] 廖華衛,李瑞珍,陳飛苑.大黃中大黃酚的提取、分離和純化方法研究[J].中國藥房,2006,17(12):956.

[5] 曹云麗,黃強,班春蘭,等.對中藥大黃中蒽醌類物質的提取分離方法的研究[J].云南中醫中藥雜志,2005,26(1):36-38.

[6] 朱慶玲,李瑞和,石文宏.大黃中大黃素的提取工藝研究[J].時珍國醫國藥,2006,17(3):388.

R284.2

：B

：1671-8194（2013）06-0063-03