聯吡啶[3,2-a:2?,3-c]-7-氮雜-吩嗪銅(I)配合物的合成、表征及其與DNA的相互作用

高云燕 曹 璐 歐植澤 陳 晨 李 嫕 王雪松

(1西北工業大學理學院,空間應用物理與化學教育部重點實驗室,西安710072;2中國科學院理化技術研究所,光化學轉換與功能材料重點實驗室,北京100190)

1 引言

順鉑類化合物是目前最有效的抗癌藥物之一.順鉑能與DNA發生共價相互作用,從而阻止DNA的轉錄和復制,最終導致細胞死亡或凋亡.1,2然而,順鉑的毒副作用大,易于引起中毒性腎損害、嘔吐、神經毒性等臨床反應,且長期使用會產生嚴重的抗藥性.3銅作為體內不可缺少的微量元素,參與多種生物化學反應.4銅配合物表現出較高的抗癌活性和較低的毒副作用,且具有潛在的腫瘤靶向作用,因而被認為是鉑類抗癌藥物的替代藥品之一.5?7

Cu配位化合物在紫外或可見光照射條件下產生的活性氧可氧化DNA的堿基,特別是鳥嘌呤(G);或與DNA的糖基發生抽氫反應,表現出較強的DNA光損傷能力.8,9能夠光損傷DNA的化合物有望在生物技術、過渡金屬藥物領域或光動力治療領域獲得應用.10目前大多數Cu配合物為二價銅配合物,一價銅配合物的光動力作用研究的相對較少.11?13鄰菲羅啉銅(I)對DNA具有識別作用,主要對TAT序列位點具有較高的親和性,并能夠通過羥基自由基等活性氧在結合位點附近對DNA進行損傷.14銅(I)配合物與DNA作用的結合常數通常較小(＜105mmol·L?1),15,16且對DNA的損傷效率較低,有時需要較高濃度的配合物或外加還原劑,這限制了Cu(I)配合物的進一步應用.17,18近年來,通過引入多個金屬中心、合成不同結構的鄰菲羅啉配體,調節鄰菲羅啉銅配合物的氧化還原電位及其與DNA的結合方式,可以有效地促進鄰菲羅啉銅配合物對DNA的氧化斷裂.19聯吡啶[3,2-a:2?,3?-c]-氮雜-吩嗪(dpapz)是一種具有較大共軛芳香環的鄰菲羅啉衍生物配體,其釕配合物與DNA具有較強的相互作用.20?22但是dpapz及其相關配合物的光物理性質、光損傷DNA的機理尚未得到詳細研究.本文通過改進dpapz的合成方法,提高了產率,進一步制備得到[Cu(dpapz)2]PF6配合物,采用多種光譜方法研究了配合物與DNA的作用方式,并對其光損傷DNA的機制進行了探討.

2 實驗部分

2.1 試劑和儀器

小牛胸腺DNA(CT DNA)、溴乙錠(EB)、[Cu(CH3CN)4]PF6均為分析純試劑(純度大于99%),購自美國Aldrich公司.硝基四氮唑藍(NBT)、對苯醌(PBQ)、9,10-二苯基蒽(DPA)、1,4-二氮雜二環[2.2.2]辛烷(DABCO)、3,4-二氨基吡啶均為分析純試劑(純度大于99%),購自美國Acros公司.1,10-鄰菲羅啉-5,6-二酮參照文獻23合成.其余試劑均為分析純,購自北京化工廠.所有溶劑經無水處理,使用前重蒸.所用緩沖溶液均為Tris-HCl溶液(10 mmol·L?1,pH 7.0),采用二次蒸餾水配制.CT DNA溶液按照文獻24的方法配制,并利用260 nm處的吸光度確定CT DNA的濃度(摩爾消光系數為6600 mol·L?1·cm?1).

所用儀器:Hitachi U-3100紫外-可見吸收光譜儀,日本;Hitachi F-4600熒光分光光度計,日本;Bio-Rad Universal Hood II凝膠成像系統,美國;Bruker Avance 400核磁共振波譜儀,德國;Waters GCT Premier高分辨質譜儀(HR ESI-MS),美國;北京六一DYCP-44N凝膠電泳儀,上海華辰CHI 660D電化學分析儀.

2.2 配合物的合成與表征

2.2.1 配體dpapz的合成

將 1,10-鄰菲羅啉-5,6-二酮(0.5 g,2.5 mmol)和3,4-二氨基吡啶(0.5 g,4.5 mmol)溶于50 mL重蒸無水乙醇中,80°C回流6 h,得黃色溶液,冰水浴冷卻1 h后有固體析出,抽濾,用冷的無水乙醇洗滌,干燥,得淺黃色固體0.55 g,產率為75%.1H NMR(CDCl3,400 MHz)δ:9.778(s,1H);9.547(m,2H);9.274(m,2H);8.945(d,1H);8.106(d,1H);7.766(m,2H).IR(KBr),ν/cm?1:3060 w,1577 s,1529 m,1473 m,1433 m,1388 m,1342 m,1247 w,1220 w,1124 m,1070 m,1026 m,977 m,893 m,821 s,739 s,628 m,580 m.

2.2.2 配合物[Cu(dpapz)2]PF6(2)的合成

將dpapz(76 mg,0.2682 mmol)溶于5 mL重蒸氯仿,通入氮氣除氧30 min后,緩慢加入5 mL[Cu(CH3CN)4]PF6(50 mg,0.1341 mmol)的甲醇溶液,50°C下反應6 h,有棕黑色沉淀產生.沉淀用二次蒸餾水、丙酮和無水乙醚洗滌數次后真空干燥,得棕黑色固體60 mg,產率為71%.1H NMR(DMSO-d6)δ:9.860(br s,6 H),9.083(bs s,6 H),8.311(br s,3 H).HR ESI-MS(MeCN):629.0985,[C34H18CuN10],m/z=629.1011([M-PF6]+).元素分析:實驗值(計算值)(%),C 64.72(64.81),H 2.94(2.88);N 22.34(22.23).IR(KBr),ν/cm?1:3084 w,1588 m,1487 m,1446 m,1380 s,1346 m,1299 m,1139 m,1080 m,831 m,729 m,640 m,582 m.

2.3 紫外-可見滴定實驗

配制 dpapz(10 μmol·L?1)及[Cu(dpapz)2]PF6(5 μmol·L?1)的緩沖溶液,逐漸滴加DNA(初始濃度為1.5 mmol·L?1)溶液,室溫靜置15 min.采用1 cm石英比色皿,以相應濃度DNA的緩沖溶液為參比,測定230?750 nm范圍內的紫外-可見光譜.

2.4 溴乙錠(EB)熒光競爭實驗

用緩沖溶液配制試樣,固定CT DNA濃度為10 μmol·L?1,EB 濃度為5 μmol·L?1,將反應液混合均勻,室溫靜置2 h后,逐漸增大dpapz及其Cu(I)配合物的濃度,靜置15 min進行熒光光譜測試,激發波長為510 nm,掃描范圍為530?750 nm.

2.5 DNA熔解曲線的測定

用緩沖溶液配制試樣,固定CT DNA濃度為50 μmol·L?1,dpapz濃度為20 μmol·L?1,或[Cu(dpapz)2]PF6濃度為 10 μmol·L?1,將反應液混合均勻,室溫靜置2 h后,由24°C逐漸加熱到96°C,升溫速率控制為1°C·min?1.將雙鏈CT DNA在260 nm處的吸收變化值分別進行歸一化后對溫度作圖,中間拐點處的溫度即為DNA的熔解溫度.

2.6 循環伏安實驗

工作電極使用玻碳電極,對電極使用鉑電極,參比電極使用飽和甘汞電極(SCE),實驗前待測溶液通氮氣除氧氣20 min,實驗過程中始終保持氮氣氣氛.配制30 μmol·L?1dpapz及[Cu(dpapz)2]PF6的緩沖溶液,支持電解質為50 mmol·L?1NaCl,測定加入CT DNA前后化合物的峰電位和峰電流的變化,掃描速率為0.1 V·s?1,測定?1.2?0.5 V范圍的循環伏安曲線.

2.7 超氧負離子自由基()測試

配體dpapz和[Cu(dpapz)2]PF6的超氧負離子自由基產生能力通過硝基四氮唑藍(NBT)與O2?·的反應測定.25光源為300 W高壓汞燈(λ＞300 nm).光照dpapz及其配合物(10 μmol·L?1)與NBT(50 μmol·L?1)的DMSO混合溶液,每隔3 min取樣,利用600 nm處的吸收變化值對光照時間作圖得到的曲線可比較不同光敏劑產生超氧負離子自由基的能力.

2.8 單重態氧(1O2)的測定

配體dpapz及[Cu(dpapz)2]PF6的1O2量子產率采用9,10二苯基蒽(DPA)光氧化法測定.26固定DPA的濃度為8×10?5mol·L?1,采用300 W高壓汞燈(λ＞300 nm)樣品,每隔10 min取樣,測定其紫外可見吸收光譜.利用DPA在374 nm處吸收值降低程度與光照時間的關系作圖,可比較不同光敏劑產生單重態氧的相對量子效率.

2.9 DNA光損傷實驗

取30μL pBR322 DNA溶液(0.5μg·mL?1,pH 7.0)與dpapz或[Cu(dpapz)2]PF6溶液混合,室溫暗處靜置20 min后,采用高壓汞燈光照20 min(λ＞300 nm).利用0.9%的瓊脂糖凝膠電泳對DNA進行分離,溴乙錠染色后,采用Bio-Rad Universal Hood II凝膠成像系統測定DNA相應組分的熒光強度.獲得超螺旋結構DNA(Form I,supercoiled)、帶切口的DNA(Form II,nicked)和線性DNA(Form III,linear)的相對百分含量.

3 結果與討論

3.1 化合物合成

通過提高反應物3,4-二氨基吡啶和1,10-鄰菲羅啉-5,6-二酮的投料比,改變反應溶劑和延長反應時間,配體聯吡啶[3,2-a:2?,3?-c]-7-氮雜-吩嗪(dpapz)的收率由文獻21報道的42%提高到75%.配體dpapz與[Cu(CH3CN)4]PF6在CHCl3和甲醇的混合溶劑中回流可得到配合物[Cu(dpapz)2]PF6(圖1).配體dpapz的結構不具有對稱性,鄰菲羅啉環上氫原子的1H NMR譜圖表現出多重峰(圖2(a)).與Cu(I)配位后,dpapz的鄰菲羅啉環上2位氫原子的1H NMR峰位明顯向低場移動,表明Cu(I)主要與配體的鄰菲羅啉部分配位,而不是與吡啶環部分配位(圖2(b)).[Cu(dpapz)2]PF6的1H NMR峰均為寬峰(圖2(b)),可能是Cu(I)配合物在溶液中形成了無定形聚集態引起的.27紅外光譜顯示,dpapz在3060 cm?1處的C―Harom伸縮振動峰在配位后向高波數方向移至3084 cm?1.同時,dpapz在1400?1600 cm?1范圍內的鄰菲羅啉部分的特征峰在配位后均發生了明顯的位移,進一步表明鄰菲羅啉基團參與了配位.28

高分辨質譜圖中,629.0985處的峰可歸屬于[Cu(dpapz)2]+的分子離子峰(理論值為m/z=629.1012),387.0408處的峰可歸屬于[Cu(dpapz)(CH3CN)]+的分子離子峰(理論值為m/z=387.0419)(圖3).同時還可觀測到dpapz配體在284.0919處的分子離子峰(理論值為m/z=284.0858).盡管質譜圖中能觀測到[Cu(dpapz)(CH3CN)]+的分子離子峰,但在配合物的紅外圖譜中未能觀測到CH3CN的特征紅外吸收,因此[Cu(dpapz)(CH3CN)]+的分子離子峰可能是質譜檢測過程中產生的.如果配體dpapz與Cu2+配位,應該可以檢測到[Cu(II)(dpapz)2]2+的分子離子峰(m/z=314.5506),或的分子離子峰(m/z=774.0659).但是在高分辨質譜圖中沒有檢測到這些Cu2+配合物的質譜峰(圖3).說明dpapz主要與銅(I)配位形成配合物,且配合物[Cu(dpapz)2]PF6具有良好的穩定性.實驗過程中,溶劑經過嚴格處理,采用Cu(NO3)2等二價銅化合物與dpapz配位時,最終產物也只有Cu(I)配合物.一價銅離子的電子構型為d10,傾向于形成四面體空間結構;而二價銅離子的電子構型為d9,主要形成具有更好平面結構的配合物.由于鄰菲羅啉類配體具有較大的空間位阻,使得具有平面結構的二價銅配合物相對不穩定,在還原劑存在條件下,鄰菲羅啉衍生物的銅(II)配合物易于被還原形成銅(I)配合物.29,30文獻報道,Cu2+能被溶劑中存在的微量還原劑或溶劑本身還原,反應生成Cu(I)配合物,具體機理還有待于進一步研究.31,32

圖1 配體dpapz和配合物[Cu(dpapz)2]PF6的合成路線Fig.1 Synthetic routes for the ligand dpapz and the complex[Cu(dpapz)2]PF6

圖2 (a)配體dpapz和(b)配合物[Cu(dpapz)2]PF6的1H NMR圖Fig.2 1H NMR spectra of ligands(a)dpapz and(b)[Cu(dpapz)2]PF6

圖3 [Cu(dpapz)2]PF6在乙腈溶劑中的HR ESI質譜圖Fig.3 High resolution electrospray ionization mass spectrum(HR ESI-MS)of complex[Cu(dpapz)2]PF6in acetonirile

3.2 紫外吸收光譜

配體dpapz在261、290、301和359 nm處有四個吸收峰,其中261、290和301 nm處的峰可歸屬于配體的π→π*躍遷,而359 nm處的吸收為配體的n→π*躍遷(圖4(a)).33隨著CT DNA的加入,dpapz的各吸收峰的強度逐漸下降.當CT DNA與dpapz的濃度比為2.5時,261和290 nm處吸收峰的減色效應分別為27.9%和23.4%,表明CT DNA與dpapz具有較強的相互作用.配體dpapz與CT DNA的結合常數可以通過公式(1)求得:

式中,D為 DNA的濃度,Δεap=|εa?εf|,Δε=|εb?εf|,εa為化合物的表觀消光系數(εa=Aobs/[化合物]),即用加入不同濃度DNA后化合物的吸光度值Aobs除以化合物濃度得到.εf為未加入DNA時,化合物的消光系數.εb為所有的化合物與DNA結合后的消光系數.Ka為化合物與DNA的結合常數.以D/Δεap對D作圖,線性擬合后得到的斜率與相應截距的比值為結合常數.利用dpapz在261 nm處的吸收峰強度的變化進行線性擬合,求得dpapz與DNA的結合常數為2.88×105mol·L?1.

配合物[Cu(dpapz)2]PF6在267和361 nm處有兩個主要吸收峰,在289和301 nm處可觀測到兩個肩峰(圖4(b)).隨著CT DNA的加入,這些峰的強度明顯下降.當CT DNA與[Cu(dpapz)2]PF6的濃度比為2.5時,267和361 nm處吸收峰的減色效應分別為75.9%和57.0%,且吸收峰分別紅移至270和363 nm處.利用267 nm處吸收峰強度的變化進行線性擬合作圖,求得[Cu(dpapz)2]PF6與CT DNA的結合常數為 5.32×105mol?1·L.[Cu(dpapz)2]PF6與 CT DNA 的結合常數與文獻20報道的dpapz釕配合物與DNA的結合常數相當.配體結構對銅配合物與DNA的結合常數和相互作用方式有較大影響.文獻15,16報道鄰菲羅啉或含吡啶環希夫堿的Cu(I)配合物與DNA的結合常數分別為4.7×104,7.23×104mol?1·L.而dpapz具有較大的芳香環面積,因而[Cu(dpapz)2]PF6與CT DNA的結合常數較高.

加入CT DNA后,[Cu(dpapz)2]PF6的減色效應大于dpapz,且CT DNA與[Cu(dpapz)2]PF6的結合常數大于與dpapz作用的結合常數,說明[Cu(dpapz)2]PF6與CT DNA的作用要強于dpapz.文獻報道,當化合物以插入方式與DNA結合時,其吸收光譜會表現出減色效應或者峰位的紅移.34但對Cu(dpapz)2]PF6而言,加入DNA后,配合物的吸收峰紅移較小(2?3 nm),且二者的結合常數要小于經典的DNA插入作用化合物(如[Ru(phen)2(DPPZ)]2+和溴乙錠(EB)等)與DNA作用的結合常數(106?107mol?1·L),35,36這說明[Cu(dpapz)2]PF6與DNA的作用可能為部分插入作用.與配體dpapz相比,[Cu(dpapz)2]PF6具有金屬離子中心,還能夠通過靜電作用和CT DNA結合,因此[Cu(dpapz)2]PF6與CT DNA的作用要強于配體dpapz本身.

圖4 不同濃度CT DNA存在下(a)dpapz和(b)[Cu(dpapz)2]PF6的紫外吸收光譜Fig.4 UV-Vis absorption spectra of(a)dpapz and(b)[Cu(dpapz)2]PF6with different concentrations of CT DNA

3.3 CT DNA熔解溫度

熔解作用是DNA的一個極其重要的物理化學性質.測定DNA的熔解溫度(Tm)是研究化合物對DNA穩定性影響的常用方法.在Tris-HCl緩沖溶液中,CT DNA的熔解溫度為72.0°C(圖5).加入dpapz和[Cu(dpapz)2]PF6后,CT DNA的熔解溫度分別上升為79.8 °C(ΔTm=7.8 °C)、83.1 °C(ΔTm=11.1 °C),說明dpapz及[Cu(dpapz)2]PF6均能很好地穩定CT DNA.化合物與雙鏈DNA以扦插方式作用時能引起DNA的熔解溫度上升10°C以上.37因此,[Cu(dpapz)2]PF6與CT DNA具有扦插作用,這與紫外吸收光譜測定實驗結果一致.而dpapz使得CT DNA的熔解溫度上升相對較小(7.8°C),且dpapz與CT DNA作用時未觀察到吸收峰紅移并且減色效應較小(圖4(a)),進一步表明dpapz與CT DNA的結合不是扦插作用,而可能采取溝槽結合的方式與CT DNA發生相互作用.38

3.4 與溴乙錠的競爭實驗

溴乙錠為共軛芳香環的平面分子,是一種熒光染料,其本身熒光強度很弱,當EB插入DNA堿基對時,形成EB-DNA復合物,使得其熒光大為增強.若其它不產生熒光的分子與DNA作用時,部分地將EB從EB-DNA復合物中擠出,從而導致EB-DNA體系的熒光強度減弱,根據Stern-Volmer方程(公式(2))得到化合物的熒光猝滅常數:39

式中I0和I分別為加入配體或配合物前后EB-DNA體系的熒光強度,r=[complex]/[DNA],KSV為猝滅常數.

隨著dpapz和[Cu(dpapz)2]PF6濃度的增加,EBDNA體系在592 nm處的熒光強度逐漸減小(圖6).以I/I0對r作圖,求得dpapz及[Cu(dpapz)2]PF6的熒光猝滅常數分別為4.52和9.86.[Cu(dpapz)2]PF6以扦插作用的方式與DNA結合,能夠與EB競爭DNA堿基對的作用位點,因而具有較大的熒光猝滅常數.40而配體dpapz以溝槽作用的方式與DNA結合,與DNA作用相對較弱,因而熒光猝滅常數相對較小.41

圖5 加入dpapz(20 μmol·L?1),[Cu(dpapz)2]PF6(10 μmol·L?1)對CT DNA(50 μmol·L?1)的熔解溫度的影響Fig.5 Normalized melting curves of CT DNA(50 μmol·L?1)with the addition of dpapz(20 μmol·L?1),[Cu(dpapz)2]PF6(10 μmol·L?1)

圖6 (a)dpapz和 (b)[Cu(dpapz)2]PF6對 EB-DNA體系熒光光譜的影響Fig.6 Emission spectra of EB-DNAin the absence and presence of(a)dpapz and(b)[Cu(dpapz)2]PF6

3.5 循環伏安測試

電化學方法是研究體系氧化還原性能的重要方法,也可以對光譜實驗結果進行有力的補充,有利于更深入地了解化合物與CT DNA的作用方式.在Tris-HCl緩沖溶液中,dpapz的還原電位分別位于?0.362和?1.025 V(vsSCE),可歸屬于吩嗪42和鄰菲羅啉環43的還原電位峰(圖7(a)).加入DNA后,dpapz的還原峰位和峰電流都變化較小,說明dpapz以非插入方式與DNA作用.44

圖7 (a)dpapz(30 μmol·L?1)和(b)[Cu(dpapz)2]PF6(30 μmol·L?1)與0和10 μmol·L?1CT DNA在10 mmol·L?1 Tris-HCl,50 mmol·L?1NaCl緩沖溶液(pH 7.0)中相互作用的循環伏安曲線Fig.7 Cyclic voltammograms of(a)dpapz(30 μmol·L?1)and(b)[Cu(dpapz)2]PF6(30 μmol·L?1)in the presence of 0 and 10 μmol·L?1CT DNAin Tris-HCl(10 mmol·L?1,pH 7.0)buffer containing NaCl(50 mmol·L?1)

[Cu(dpapz)2]PF6在Tris-HCl緩沖溶液的還原電位分別位于?0.440和?1.110 V(vsSCE)(圖7(b)),要低于配體相應的還原電位.加入CT DNA后,[Cu(dpapz)2]PF6的還原峰分別正移至?0.410和?1.080 V(vsSCE),且峰電流明顯下降,說明配合物中dpapz配體部分與CT DNA有較強的相互作用.一般來說,插入作用導致金屬配合物還原峰電勢正移.同時,配合物與DNA進行插入作用形成穩定配合物后,溶液中自由配合物濃度降低,使得單位時間內遷移至電極表面的配合物分子數減少,從而導致配合物的還原峰電流降低.45在0.1398和0.2534 V(vsSCE)處分別還可檢測到一對可逆的氧化還原峰,可歸屬于[Cu(dpapz)2]PF6中的Cu(II)/Cu(I)的氧化還原峰.46加入DNA后,[Cu(dpapz)2]PF6中Cu(II)/Cu(I)的還原峰由0.1398 V正移至0.1409 V(vsSCE),而氧化峰則由0.2534 V正移至0.2978 V(vsSCE),說明Cu(I)離子也參與了配合物與DNA的相互作用.但是Cu(II)/Cu(I)的氧化峰電流和還原峰電流在加入DNA后都增加,說明配合物[Cu(dpapz)2]PF6中Cu(I)與DNA作用方式可能是靜電相互作用.47Cu(I)配合物一般采取四面體結構配位,因而配體與DNA進行部分插入作用,而Cu(I)離子本身采取靜電作用的方式與DNA結合,12這也與紫外吸收和DNA溶解溫度變化實驗研究結果相符合.

3.6 超氧負離子自由基的產生

圖8 三乙胺存在下利用硝基四氮唑藍(NBT,50 μmol·L?1)法測定dpapz和[Cu(dpapz)2]PF6的O2??的產率Fig.8 Relative quantum yields of O2?? by dpapz and[Cu(dpapz)2]PF6via nitro blue tetrazolium(NBT,50 μmol·L?1)method in the presence of triethylamine

3.7 單重態氧的產生

9,10-二苯基蒽(DPA)能與單重態氧發生環加成反應,并引起DPA的吸收下降.通過比較DPA的特征吸收峰在374 nm處的下降(圖9),可了解光敏劑產生單重態氧的能力.圖9插圖為[Cu(dpapz)2]PF6和DPA的乙醇溶液經光照后,在350?400 nm范圍內吸收光譜的變化.加入單重態氧猝滅劑DABCO后,溶液的吸收光譜的下降明顯減弱,說明DPA的吸收下降是由于單重態氧引起的.圖9的結果表明[Cu(dpapz)2]PF6和dpapz產生單重態氧的能力相當.

3.8 DNA的光損傷測定

超螺旋結構雙鏈質粒DNA(Form I)中的一條DNA鏈段受到損傷時,可形成結構相對松弛的環狀DNA(單鏈斷裂,Form II).環狀DNA的切口附近發生損傷后,進一步形成線性DNA(雙鏈斷裂,Form III).49利用瓊脂糖凝膠電泳可將這三種具有不同構象的DNA進行分離,并采用凝膠成像儀進行定量分析.本文采用pBR322 DNA作為模型DNA,研究光照條件下dpapz和[Cu(dpapz)2]PF6對DNA的光損傷作用.將dpapz或[Cu(dpapz)2]PF6與DNA暗處靜置20 min,或單獨光照DNA溶液均未觀測到明顯的DNA損傷,僅有少量的Form II結構DNA(相對含量＜5%),可能是DNA自發裂解引起的(圖10(a)Lane 1和圖10(b)Lane 1).當采用高壓汞燈光照dpapz與DNA 的混合溶液 20 min時(λ＞300 nm),pBR322 DNA的組成發生了變化,超螺旋結構DNA的含量為55.31%(圖10(a)Lane 2和圖10(b)Lane 2).而[Cu(dpapz)2]PF6與DNA溶液經過光照20 min后,大部分質粒DNA轉變成為環狀DNA(54.97%)或線性DNA(38.01%),僅剩余少部分超螺旋結構DNA(7.02%)(圖10(a)Lane 6和圖10(b)Lane 6),說明[Cu(dpapz)2]PF6對DNA的光損傷作用要強于配體dpapz.

圖9 9,10-二苯基蒽(DPA,80 μmol·L?1)光氧化法測定dpapz和[Cu(dpapz)2]PF6在乙醇中的單重態氧量子產率Fig.9 9,10-Diphenylanthracene(DPA,80 μmol·L?1)bleaching method for measuring the quantum yields of 1O2of dpapz and[Cu(dpapz)2]PF6in ethanol solution

加入不同活性氧的猝滅劑,可研究光敏劑光損傷DNA的機理.加入超氧負離子自由基猝滅劑對苯醌PBQ后,dpapz和[Cu(dpapz)2]PF6對DNA的光損傷作用明顯減弱,超螺旋結構DNA的含量分別升高為65.26%和57.89%(圖10(a),Lanes 3和7;圖10(b),Lanes 3和7).而單重態氧猝滅劑DABCO和羥基自由基猝滅劑甘露醇的加入對dpapz和[Cu(dpapz)2]PF6光損傷DNA的影響相對較小(圖10(a)Lanes 4,5,8和9;圖10(b),Lanes 4,5,8和9).上述結果表明,超氧負離子自由基、單重態氧和羥基自由基均參與了dpapz和[Cu(dpapz)2]PF6的DNA光損傷作用.

圖10 (a)dpapz(5 μmol·L?1)和[Cu(dpapz)2]PF6(5 μmol·L?1)光損傷pBR322質粒DNA的瓊脂凝膠電泳圖;(b)不同泳道中質粒DNA成分的百分含量Fig.10 (a)Agrose gel electrophoresis patterns of pBR322 plasmid DNAfor the light-induced DNAcleavage activity of dpapz(5 μmol·L?1)and[Cu(dpapz)2]PF6(5 μmol·L?1);(b)the percentage of plasmid DNAform in different lanes

DNA中的G堿基具有較低的氧化電位,能夠與多種光敏劑發生光誘導電子轉移反應.50配體dpapz或[Cu(dpapz)2]PF6與DNA發生電子轉移反應生成負離子自由基和DNA正離子自由基(公式(3)).而dpapz或[Cu(dpapz)2]PF6負離子自由基與氧反應生成超氧負離子自由基(公式(4)),超氧負離子自由基以及通過歧化反應生成的羥基自由基都可以損傷DNA,這使得超氧負離子自由基成為引起DNA損傷的主要活性氧物種.[Cu(dpapz)2]PF6通過靜電作用和部分扦插作用等多種方式與DNA作用,結合常數更高,因而[Cu(dpapz)2]PF6產生的活性氧能夠更有效地對DNA進行光損傷.

4 結論

合成了dpapz及其配合物[Cu(dpapz)2]PF6,并采用多種方法對其結構進行了表征.[Cu(dpapz)2]PF6具有良好的穩定性,保持了產生超氧負離子自由基和單重態氧的能力.[Cu(dpapz)2]PF6通過靜電作用和部分扦插作用與DNA結合,具有較高的結合常數.在光照條件下,[Cu(dpapz)2]PF6光損傷DNA的效率明顯高于配體dpapz,說明選擇合適的配體是增強Cu(I)配合物對DNA的親和性和提高DNA光損傷能力的有效途徑.

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