經皮注射醫用臭氧治療兔VX2移植瘤的實驗研究

韓世龍，朱曉黎，張猛，郭永團，徐云華

臭氧是一種強氧化劑，常溫常態下半衰期約150 min，具有免疫激發、消炎、止痛及溶解髓核內蛋白多糖的作用［1］。近年來，臨床上應用臭氧經皮注射治療腰椎間盤突出癥，自體血臭氧回輸治療缺血性腦卒中，局部吹注臭氧治療難愈性潰瘍均取得了一定進展［2-3］。1980年Sweet等［4］曾報道體外實驗表明，臭氧濃度在0.3×10-6～0.5×10-6時可抑制40%～60%的腫瘤細胞，0.8×10-6時可抑制90%的腫瘤細胞，但臭氧抑制及殺滅腫瘤的作用尚未為人們所重視，本實驗旨在探索臭氧在腫瘤治療中的新途徑及其安全性和有效性，為臨床臭氧治療實體腫瘤的應用提供實驗數據支持及臨床指導。

1 材料與方法

1.1 實驗動物建模及分組

取普通級純種成年雄性新西蘭大白兔24只，兔齡4個月左右，體重2.2～2.5 kg。

1.1.1 動物建模選擇VX2荷瘤兔，無菌條件下切取瘤體，取靠近腫瘤邊緣的灰白色魚肉樣實性瘤組織，無菌生理鹽水中用眼科剪剪成大小約1.0 mm3的瘤塊，滴入慶大霉素注射液1 ml抑菌備用，在實驗兔的兩側臀部近大腿根處肌肉豐厚處接種VX2瘤株，2周后B超證實腫瘤直徑達1.6～3.4 cm，平均（2.3±0.85）cm時，即為瘤兔模型。

1.1.2 動物分組24只VX2瘤兔建模成功后，分為三組，A、B組各9只，C組6只。A組注射醫用臭氧的濃度為40μg/ml，B組為70μg/ml，C組為假手術組，即以同樣方法穿刺到位后，不注入任何氣體或液體。

1.2 實驗過程

實驗動物全麻后，B超實時監測下刺入5 ml注射器針頭，確定針尖避開周圍血管置入腫瘤中心部分，分別制備40μg/ml和70μg/ml臭氧，抽吸2 ml，監測下回抽證實未在血管腔內，注入腫瘤組織，注射過程中，同樣注意觀察臭氧有無進入血管，B超可見腫瘤局部高亮回聲（圖1），于荷瘤兔腫瘤生長良好的一側，單點注射，一次性完成。B超再次觀察腫瘤組織大小及毀損區大小。術后常規飼養。

1.3 觀察指標及方法

術后每天觀察瘤兔的一般生活情況，于術前1 d、術后1、3 d分別從兔耳緣抽取靜脈血，檢測血清丙氨酸轉氨酶（ALT）、天冬氨酸轉氨酶（AST）及肌酐（Cr）水平。各組實驗動物于術后3 d處死，取瘤體標本進行HE染色。切取病灶內消融灶中心組織及邊緣組織為檢測標本，切除的標本立即在4%甲醛液中固定，行HE染色。

1.4 統計學分析

采用SPSS13.0軟件進行統計學分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示，統計前經方差齊性檢驗，各組間比較采用方差分析，兩兩比較采用Bonferroni檢驗，組內比較采用t檢驗，計數資料采用卡方檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 治療后動物一般情況

三組動物術后24 h內均出現活動減少、納差，對刺激反應差，精神萎靡，24 h后基本恢復正常，以A、B組實驗動物表現明顯。A、B組各有1只兔于術中或術后1 h內死亡，2只兔均為術中注射臭氧后出現呼吸急促、抽泣樣呼吸、躁動，唇紺，于胸外按壓胸廓行心肺復蘇后搶救無效死亡，考慮為實驗初期操作經驗缺乏，臭氧進入血管，氣體栓塞所致，死亡兔均及時補充。B組1只兔術后出現短暫性跛行后自愈。余兔均未出現嚴重并發癥。

2.2 干預前后血清肝、腎功能變化

干預前1 d各組血清ALT、AST和Cr水平無明顯差異。術后1 d各組血清ALT、AST及Cr水平達到峰值，與術前1 d相比無顯著差異；術后3 d血清ALT、AST、Cr水平開始下降并趨于術前水平，各組間兩兩比較亦無顯著差異（表1～3，圖2）。

表1 各組干預前后丙氨酸轉氨酶水平比較（±s）

表1 各組干預前后丙氨酸轉氨酶水平比較（±s）

a與術前比較P＜0.05

?

表2 各組干預前后天冬氨酸轉氨酶水平比較（±s）

表2 各組干預前后天冬氨酸轉氨酶水平比較（±s）

a與術前比較P＜0.05

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表3 各組干預前后血清肌酐水平比較（±s）

表3 各組干預前后血清肌酐水平比較（±s）

a與術前比較P＜0.05

?

2.3 大體標本觀察

肉眼可見臭氧治療兩組腫瘤病灶外有完整包膜存在，沿包膜肌纖維走行逐步解剖腫瘤組織，可見腫瘤局部充血腫脹，腫瘤內消融區周邊為乳白色乳糜樣壞死組織，中間區液化壞死組織，A、B組間壞死區大體標本無明顯差異。C組接種腫瘤處可見腫瘤呈近似圓柱形，灰白色魚肉樣實性腫瘤組織。

2.4 病理學觀察

光鏡下觀察A、B組，消融導致的細胞壞死形態基本相同，腫瘤細胞與周圍正常組織細胞界限清晰，可見腫瘤細胞侵犯肌層，腫瘤細胞可見大片凝固壞死，表現為組織、細胞結構破壞，部分形態尚存，見細胞破裂、溶解、壞死細胞碎片。C組鏡下僅見少量壞死腫瘤細胞，腫瘤與附近組織界限清晰，部分腫瘤細胞突破肌層向深處生長，腫瘤細胞排列紊亂，呈巢狀或彌漫性分布，可見大量癌巢形成，細胞核深染，可見核分裂，異性核（圖3）。

3 討論

3.1 醫用臭氧治療惡性腫瘤的可行性

臭氧作為一種強氧化劑，近年來國內醫生在臨床上主要用于治療腰椎間盤突出癥、缺血性腦卒中及難愈性潰瘍，而對其在抑制腫瘤生長和治療腫瘤方面的作用少有報道。1995年美國國立衛生研究院將氧化劑（臭氧、過氧化氫）作為五類抗腫瘤治療方法之一，其中包括螯合作用、代謝治療、細胞治療和抗氧化劑治療。有報道臭氧在晚期頭頸部腫瘤患者作為輔助治療與靜脈化療聯合應用，結果表明臭氧治療可能有助于增加靜脈化療的效果。此外，在另一組晚期頭頸部腫瘤采用化療及放射治療聯合自血回輸臭氧療法，結果表明臭氧治療可能既增加靜脈化療效果，又增加放射治療效果［5-6］。2008年有報道采用經皮腹膜內注射臭氧治療新西蘭大白兔耳VX2移植瘤，14只荷瘤兔中6只腫瘤消失，取得了滿意的治療效果。國內有報道經皮瘤內注射醫用臭氧治療VX2移植瘤的動物實驗，顯示該治療方法可有效控制腫瘤生長，減少腫瘤轉移。

本組實驗采用經皮穿刺瘤體B超引導下直接注射臭氧。在預實驗中使用CT為引導方法，發現缺乏實時性，不能降低治療過程中造成氣體栓塞的風險，實驗中改用B超為引導工具，對腫瘤組織進行實時定位、測量腫瘤組織大小等操作。預實驗過程中先后注射了3～5 ml臭氧觀察，其死亡率均較高，反復預實驗結果顯示2 ml是安全劑量。實驗過程中死亡的2只荷瘤兔出現氣體栓塞等表現，經胸外按壓等搶救后未成功，考慮為實驗早期操作者應用B超熟練度欠佳及穿刺方法失范有關。

3.2 醫用臭氧治療的毒性作用及對肝腎功能影響

相關研究證實臭氧毒性主要表現在以下方面：①有證據表明臭氧對氣管、肺臟非常有害，且隨著空氣中臭氧濃度增加，其毒性作用相應增加［3，7］。②臭氧作為強氧化劑與DNA、RNA等生物大分子反應，可能導致其結構受損，存在潛在的遺傳毒性。但這一結論尚存在爭議［8］。③臭氧鞘內注射可導致腦脊液中具有細胞毒性作用的丙二醛水平升高，這表明臭氧有較為確切的神經毒性［9-10］。目前尚無其他研究證實臭氧對肝腎功能是否有影響。本實驗檢測了兩組不同濃度臭氧局部注入腫瘤前后肝腎功能的變化，結果表明低劑量瘤內注射臭氧后，血清ALT、AST及Cr術后1 d有輕度升高，3 d后恢復基線水平，血清ALT、AST及Cr升高后對肝腎功能的影響無統計學意義。這一結果證實，局部實體內注入醫用臭氧后，不會對全身肝腎功能造成損傷，同時實驗過程中也未發現其他器官功能的顯著衰退。

3.3 各組術后大體標本和病理分析

本實驗中A、B兩組腫瘤內消融區周邊為乳白色乳糜樣壞死組織，中間有液化壞死組織，病理標本可見細胞溶解、破裂等細胞壞死表現，兩組無明顯差異，證實臭氧濃度在40～70μg/ml，其組織破壞、穿透力、消融能力無明顯差異。其可能的機制為：臭氧是一種強氧化劑，極不穩定，進入組織后能與水分子結合生成過氧化氫、過氧化自由基和羥自由基，其反應活性極高，能攻擊細胞膜、線粒體膜同時攻擊DNA造成多種形式的損傷，使生物膜破裂導致細胞核破裂、溶解，最終導致細胞壞死［11］。同時自由基與生物膜內的不飽和脂肪酸反應，造成脂質過氧化增強，引起自由基連鎖反應，造成附加損傷［12］。

本實驗結果表明，醫用臭氧經皮治療實體腫瘤在嚴格規范的操作下是安全的，且對肝腎功能影響較小，可造成腫瘤組織壞死。本實驗為臭氧在經皮治療腫瘤方面的初步實驗，未能觀察干預治療后瘤兔的生存期，由于條件限制未能觀察單次治療后腫瘤組織的生長、轉移情況及毀損范圍，其對腫瘤的消融作用機制有待進一步研究。臭氧治療具有價廉、創傷小、可反復治療等優點，有著廣闊的應用前景，值得進一步探索。

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