肝動脈化療栓塞術對肝細胞癌組織中缺氧誘導因子1α 及Foxp3 表達的影響及意義

宋浩 于友濤 何東風 李倩

宋浩, 于友濤, 何東風, 等. 肝動脈化療栓塞術對肝細胞癌組織中缺氧誘導因子1α 及Foxp3 表達的影響及意義[J/CD].中華介入放射學電子雜志, 2013, 1(2): 78-81.

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）起病隱匿，進展快。很多患者就診時已經是癌癥晚期，錯過了手術治療的機會。經導管肝動脈化療栓塞術（transcatheter arterial chemoembolization,TACE）是非手術治療的首選方法，其近期效果得到了普遍的認可，并且為部分患者爭取到根治性治療的機會，但是遠期療效并不令人滿意[1]。惡性腫瘤的發生原因之一是腫瘤細胞逃避免疫監視，CD4+CD25+調節性T 細胞（Treg）在免疫耐受中影響免疫系統對腫瘤抗原的應答，影響腫瘤的發生發展[2]。而Foxp3是CD4+CD25+Treg 發育和功能的決定因素，是CD4+CD25+Treg 的特異標志[3]。同時，有相關文獻指出局部缺氧能促進Foxp3 的表達，并且被認為是缺氧誘導因子（hypoxia-inducible factor 1，HIF-1α）起著重要的作用[4-5]。本研究的目的是探討經過TACE 治療后的肝細胞癌殘癌組織中HIF -1α 對腫瘤局部免疫微環境的影響，為改善腫瘤預后提供新的思路。

材料與方法

一、材料

收集2002 年1 月—4 月，哈爾濱醫科大學附屬第三醫院介入科行TACE 術后Ⅱ期手術切除的HCC 患者組織標本31 例（TACE 治療組）。選取同期未經過任何治療直接行手術切除HCC 患者的組織標本37 例（單純手術組）。TACE 治療組患者手術前接受1～4 次的TACE 治療，其中19例≤2 次，5 例＞2 次，平均1.7 次/例。TACE術中藥物及栓塞材料包括表柔比星20～40 mg、絲裂霉素10～20 mg、羥喜樹堿5～20 mg、氟尿苷250～1000 mg、碘油10～30 ml、明膠海綿碎屑。末次TACE 到Ⅱ期手術切除間隔時間為13～226 d，平均22.1 d。兩組患者在年齡、性別、有無肝硬化病史、病灶大小、病灶數目、AFP 值及肝功能Child-Pugh分級方面差異均無統計學意義（P均＞0.05）。

二、方法

1.檢測方法

（1）主要試劑：HIF-1α 單克隆抗體（型號ZM-0342）、兔抗人Foxp3 單克隆抗體（型號ZM-0436）、抗兔免疫組化SP 試劑盒（編號SP-9001）、DAB 顯色試劑盒（編號ZLI-9017）、APES 防脫片劑（編號ZLI-9003）、PBS 緩沖液（編號ZLI-9063），均購自北京中杉金橋生物公司。

（2）切片準備：每個肝癌組織蠟塊標本厚4 μm，連續切片3 張。

（3）免疫組織化學染色：用過氧化物酶標記的聯酶卵白素染色法（SP 法），常規脫蠟水化，組織抗原高壓蒸汽修復。PBS 清洗后滴加一抗（用來檢測HIF-1α 的組織切片滴加一抗前需經10%山羊血清封閉）。于4℃冰箱中過夜后，置室溫下20 min，沖洗，DAB 染色，蘇木精復染。封存固定。每組用已知陽性作對照，以PBS 代替一抗做陰性對照。

2.結果分析：光鏡下HIF-1α 以細胞質或細胞核有棕黃色顆粒為陽性染色。高倍鏡（×200）下分別選取陽性染色最明顯的5 個視野，每個視野統計200 個細胞，共1 000 個細胞。計算每張切片陽性細胞百分率，分4 級：≤10%為0，11%～25%為＋，26%～50%為＋＋，＞50%為＋＋＋。本研究規定切片陽性細胞百分率≤25%為陰性。Foxp3蛋白表達為藍紫色顆粒。以Foxp3+淋巴細胞數量作為組織中Treg 數量。每張切片取5 個高倍視野（×400），定性標準參照HIF-1α 的定性辦法。

3. 統計學分析方法：使用SPSS 13.0 統計學軟件包進行數據分析，采用χ2檢驗（必要時使用Fisher 精確概率檢測法）。計量資料以±s表示；HIF-1α、Foxp3 的相關性分析采用Spearman 等級相關檢驗，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

結 果

一、兩組標本HIF-1α 蛋白及Foxp3 表達情況（表1，圖1、2）

TACE 治療組肝癌組織標本中HIF-1α 蛋白表達陽性率平均為90.3%，較單純手術組（6.6%）高，兩組差異有統計學意義（χ2=6.785，P＜0.05）。TACE 治療組肝癌組織標本中Foxp3 蛋白表達平均為87.3%，高于單純手術組（65.4%），兩組差異有統計學意義（χ2=6.399，P＜0.05）。

表1 兩組肝細胞癌患者HIF-1α 和Foxp3 表達的比較[例數，百分率（%）]

二、TACE 治療組殘癌組織中HIF-1α 與Foxp3蛋白陽性表達的相關情況

在TACE 治療組中，HIF-1α 蛋白陽性表達與Foxp3 蛋白陽性表達水平呈正相關（r=0.537，P=0.006）。

圖1 TACE 組術后殘癌組織（A）及單純手術組切除肝細胞組織（B）HIF-1α 蛋白表達（SP，×400）圖2 TACE 組術后殘癌組織（A）及單純手術組切除肝細胞組織（B）Foxp3 表達（SP，×400）

討 論

楊秀華等[6]研究發現，腫瘤周圍肝組織中CD4+CD25+Treg含量明顯高于腫瘤及正常肝臟組織，并且隨著CD4+CD25+Treg 的增加，CD8+T 淋巴細胞出現減少的趨勢。Treg 能夠通過抑制CD8+T 細胞對白細胞介素2 基因的轉錄和表達，來抑制T 淋巴細胞的活化與增殖，從而使局部微環境呈免疫抑制狀態。而且這種抑制作用是通過細胞的直接接觸或細胞因子而作用，促進了腫瘤的發生、發展，與預后成負性相關[7]。Jones 等[8]采用anti-CD25mAb去除調節性淋巴細胞以抑制惡性黑色素瘤生長，證明CD4+CD25+Treg 在人類腫瘤微環境下通過對CD8+T 淋巴細胞的抑制參與了腫瘤的免疫抑制，通過去CD4+CD25+Treg，可以解除其對免疫細胞的抑制作用。

腫瘤內各種炎性細胞相互作用可促進惡性腫瘤的進展。TACE 可造成腫瘤細胞缺血、缺氧致壞死，同時也增加了局部腫瘤組織炎性介質的釋放。在治療HCC 的同時，TACE 對機體免疫功能的影響不容忽視[9]。至于對Treg 的鑒定，Foxp3 得到了較多的認可。鄭啟昌等[10]研究發現Foxp3 蛋白在腫瘤組織中的表達與CD4+CD25+Treg 變化相平行，并且是其發育和功能的決定因素，被認為是CD4+CD25+Treg 的特異標志[3]。在試驗中，通過用免疫組織化學法檢測TACE 術后Ⅱ期切除殘癌組織，顯示TACE 治療組Foxp3 表達高于單純手術組（P＜0.05）。所以，這可能是造成TACE 治療HCC 遠期效果不令人滿意的原因之一。而Xiong等[11]在對TACE 術前、術后外周血中的Treg 進行比較分析時，發現TACE 術前、術后患者外周血中Treg 均高于健康人，但差異無統計學意義，這可能是由于TACE 所致腫瘤局部缺氧而Treg 在局部增多，由于血流的阻斷，不能與外周血溝通，從而對外周血中的Treg 影響較小。但項研究同時指出，TACE 術后1 個月的血中Treg 水平可以對HCC 預后進行判斷，這可能是由于新生血管形成，使局部CD4+CD25+Foxp3+Treg 部分釋放至外周血。而本試驗中TACE 術后再行切除手術的間隔時間平均為22.1 d。所以這兩項研究結果并不矛盾。

由此可見，Treg 對腫瘤的發生發展有著重要的影響，是判斷HCC 患者預后的獨立因素。目前對Foxp3 及Treg 高表達原因的研究較少。陳瑞清等[12]用線栓大鼠大腦中動脈的方法進行研究，發現腦缺血大鼠外周血中表達CD4+CD25+Treg，并且腦組織中也有Foxp3 的表達。而對照組（假手術組）的大鼠大腦中無Foxp3 表達，即便在手術組的大鼠中，未缺血側也僅有少量Foxp3 表達。這說明缺血是Foxp3 及CD4+CD25+Treg 始動因素之一。缺血必然伴隨著局部組織缺氧，而在實體腫瘤中，缺血缺氧是一個普遍存在的現象。腫瘤局部組織在缺氧環境下，細胞內缺氧反應基因的轉錄和表達發生了改變，TACE 無疑使腫瘤局部微環境中的氧含量進一步降低。

HIF-1 是調節細胞缺氧的一個重要因子，主要由HIF-1α 和HIF-1β 兩種亞基組成。在含氧量正常的組織中，因為組織可降解HIF-1α，HIF-1α維持在一個較低的水平；而組織缺氧可破壞這種機制，使HIF-1α 的降解便受到影響，導致組織中HIF-1α 的含量提高。HIF-1α 是主要的氧調節亞基，介導缺氧反應元件的調控，使得缺氧反應元件的轉錄增強，表達產物增多，可產生多種生物學效應。并且HIF-1α 對免疫微環境的影響，已經有過相關報道。但是多為體外細胞培養及動物實驗中證實。Ben-Shoshan 等[13]用體外培養細胞的方法研究發現，HIF-1α 可以通過激活和促使Treg 增殖，來促使局部免疫抑制的形成。在T 細胞中，HIF-1α 可以負向調節小鼠CD4+和CD8+T 細胞，敲除HIF-1α基因小鼠的T 細胞明顯呈增殖狀態[14]，這說明HIF-1α 是造成免疫抑制的因素之一，但具體機制尚未闡述。前文述及Treg 細胞也能夠抑制CD4+和CD8+T 淋巴細胞的活化與增殖，而這兩種抑制作用是否直接關聯鮮見報道。本試驗結果顯示，TACE治療組HIF-1α 及Foxp3 均高于單純手術治療組（P ＜0.05）。并且TACE 治療組HIF-1α 與Foxp3表達水平呈正相關。這一結果為上述兩種免疫抑制作用之間建立了部分聯系。

綜上所述，TACE 在栓塞HCC 供血動脈使其缺血壞死、限制腫瘤生長的同時，腫瘤局部微環境也發生了十分復雜的變化，促使多種因子表達水平上調[15]，也使局部病灶HIF-1α 及Foxp3 的表達水平上調，促進了CD4+CD25+Treg 細胞的增殖與活化，抑制免疫細胞對腫瘤的監視、清除、抑制等作用，從而影響腫瘤的發生與發展。針對HIF-1α 及Foxp3 的靶點藥物結合介入治療可能改善TACE 術的預后，為HCC 以TACE 為主的綜合治療提供了新的思路。

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