苦碟子注射液指紋圖譜的研究

彭振宇 宋玉國 申玉華

苦碟子注射液指紋圖譜的研究

彭振宇 宋玉國 申玉華

目的采用 HPLC法建立苦碟子注射液的指紋圖譜。方法以綠原酸、咖啡酸、阿魏酸、木犀草苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、菊苣酸混合對照品為參照物；色譜柱Phenomenex Luna C18 4.6mm×250mm，5μm；柱溫40℃；檢測波長為327nm；以乙腈-0.4%磷酸溶液系統為流動相進行梯度洗脫，流速0.9ml/min。結果30批供試品液相色譜圖中，均檢出10個特征峰，相似度不低于0.9。結論為苦碟子注射液的質量評價提供了依據。

苦碟子注射液；指紋圖譜；高效液相色譜法；木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷

隨著對中藥注射劑的日益關注，急需建立簡便、實用、全面、有效的質量評價體系，中藥材從其化學成分角度來講，是一個具有多種結構類型成分的化合物庫，因此僅僅通過控制某一指標性成分的含量而評價成品的整體質量是不充分的。中藥指紋圖譜技術作為控制和評價中藥材、半成品和成品質量的一個有效方法，近年來成為中藥質量控制研究的熱點，是國際上公認的控制中藥材質量的有效手段之一。苦碟子注射液現行國家藥品標準采用高效液相色譜法測定腺苷的含量，其中重要的有效成分黃酮類，僅采用紫外分光光度法測定了總黃酮的含量。根據文獻報道，苦碟子主要含有三萜、黃酮、倍半萜內酯、核苷、香豆素等成分，其中木犀草素、芹菜素類成分，具有明顯擴張冠脈回流量及降低冠脈血管阻力的良好作用，因此，建立以黃酮類化合物為參照的指紋圖譜方法，可有效控制產品的內在質量，具有良好的現實意義。苦碟子注射液的有效成分為黃酮類，其中已確定為活性成分的木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷已分離出單體（我所與企業合作），并確定了結構，另外經查閱文獻，苦碟子中含有較多有機酸類成分，故我所篩選了一些黃酮類和有機酸類對照品作為參照進行實驗，摸索建立以黃酮類化合物為特征峰的指紋圖譜測定方法。

1 儀器與試藥

島津 LC-20A高效液相色譜儀；色譜柱：Phenomenex Luna C18（4.6×250mm）。乙腈為色譜純（Fisher公司）；磷酸為色譜純（Fisher公司）；甲醇為色譜純（Fisher公司）。

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1 參照物溶液的制備取綠原酸、咖啡酸、阿魏酸、木犀草苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、菊苣酸對照品適量，加50%甲醇制成每1ml各含0.05mg混合溶液，即得。

2.1.2 標準提取物溶液的制備取本品約0.1g，置25ml量瓶中，加50%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.1.3 供試品溶液的制備取樣品30批，華夏藥業提供的小樣4批（編號100621hx、100622hx、100623hx、100624hx），作為供試品，雙鼎制藥提供了企業自制的標準提取物（簡稱標提物）。供試品溶液的制備：取本品適量，用0.45μm濾膜濾過，即得。標準提取物制備：取約0.1g，精密稱定，至25ml容量瓶中，加50%甲醇至刻度，搖勻，作為標準提取物溶液。

2.2 色譜條件色譜條件：色譜柱Phenomenex Luna C18 4.6mm×250mm，5μm；流動相A為乙腈，B為0.4%磷酸溶液（ml/min），按表1程序進行梯度洗脫，流速0.9ml/min；檢測波長為327nm；柱溫40℃。

表1 流動相程序表

2.3 測定波長的選擇觀察樣品各個波長的色譜圖，在327nm的色譜圖，兩個主峰的峰高均較高，兩峰比例適中，檢出的峰較多，基線比較平整，并且 327nm為有機酸的最大吸收峰，故選擇 327nm為測定波長。

2.4 方法學考察

2.4.1 精密度試驗取一份樣品按照供試品溶液制備方法制備供試品，在上述色譜條件下連續進樣 6次。結果共有峰相對保留時間的 RSD值均小于2.0%，相對峰面積比值均小于3.0%，表明此方法精密度良好。

2.4.2 重復性試驗依供試品溶液方法平行配制 6份供試品溶液，在上述色譜條件下進行測定。結果表明，各共有峰相對保留時間的 RSD值均小于2.0%，各共有峰相對峰面積的RSD值均小于3.0%，表明本方法重復性良好。

2.4.3 穩定性試驗取同一份供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24h進行測定。結果表明，各共有峰相對保留時間的RSD值均小于2.0%，各共有峰相對峰面積的RSD值均小于3.0%，表明本方法穩定性良好。

2.5 指紋圖譜測定測定方法：精密吸取上述各類供測溶液，注入高效液相色譜儀，測定。

2.5.1 保留時間的匹配取上述各類供測溶液的高效液相色譜圖，分析及統計，結果在 10～90min，34批供試品共出峰13個，80%以上樣品所具有的峰規定為共有峰，共有10個以此作為特征峰，其中對照品相對應的有6個，其余4個相對保留時間分別為0.184±1%、0.279±1%、0.40±1%、1.15±1%處。

2.5.2 相對保留時間匹配以木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷為參比峰，分別計算供試品、參照物、標準提取物中各峰與標準峰保留時間的比值（相對保留時間），結果，30批供試品和4批華夏小樣匹配良好，各特征峰的相對保留時間差距極小，34批樣品最小、最大值之差最大僅為0.003，相同時間段的參照物、標準提取物的相對保留時間也在此范圍內。對最小、最大值與均值之差相對于均值的百分率進行了統計，最大偏移僅為1.087%。

3 結論

將供試品液相色譜圖導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012.1版本），截取保留時間 5～90min圖譜，以供試品指紋圖譜為參照圖譜，設置全譜匹配參數為0（即峰面積占總峰面積的0%以上的峰參加匹配），以2、8、9號峰多點校正，全譜峰匹配，時間窗寬度0.3，原始圖譜見圖1，匹配后圖譜見圖 2，生成對照指紋圖譜。結果以參照圖譜為對照，相似度為0.826～0.998（詳見表2），以對照指紋圖譜為對照，相似度為0.919～0.998。

表2 分析結果[參照圖譜文件名為：16-Detector A(327nm).cdf]

暫定供試品液相色譜圖（圖3）中，以對照品液相色譜圖（圖4）為對照，應檢出綠原酸、咖啡酸、阿魏酸、木犀草苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、菊苣酸，并且以木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷為標準峰，分別在相對保留時間為0.184±1%、0.279±1%、0.40±1%、1.15±1%處檢出峰。將供試品液相色譜圖導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版本），截取保留時間5～90min圖譜，設置全譜匹配參數為0（即峰面積占總峰面積的 0%以上的峰參加匹配），以 2、8、9號峰多點校正，全譜峰匹配，時間窗寬度0.1，計算相似度，不得低于0.90。

圖1 原始圖譜

圖2 匹配后圖譜

圖3 供試品色譜圖

圖4 對照品指紋圖譜

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Study on HPLC Fingerprint of Kudiezizhusheye

Peng Zhenyu Song Yuguo Shen Yuhua

ObjectiveThe HPLC fingerprints of kudiezizhusheye were established.MethodsUse the chlorogenic acid、caffeic acid、ferulic acid、luteolin-7-O-glucoside、luteolin-7-O-β-D-glucuronopyranoside、cichoric acid as the reference substance;a column of Phenomenex Luna C18 4.6mm×250mm,5μm; Column temperature was 40℃,and 327nm as the detection wavelength; determination was conducted by the gradient elution with acetonitrile and 0.4% phosphoric acid, flow rate at 0.9ml?min-1.ResultsWith 30 batches of test articles, all can detected 10 characteristic peak, the similarity index not less than 0.90.ConclusionThis method can provide basis estimation of quality for kudiezizhusheye.

Kudiezizhusheye; Fingerprints; HPLC; Luteolin-7-O-β-D-glucuronopyranoside

R927.2

A

1673-5846(2013)07-0029-04

吉林省食品藥品檢驗所，吉林吉林 132000