二角菱殼和四角菱殼不同提取物抗氧化能力比較研究※

裴 剛胡喬銘向德標羅李娜丁揚洲袁 園

二角菱殼和四角菱殼不同提取物抗氧化能力比較研究※

裴 剛1胡喬銘2向德標2羅李娜2丁揚洲2袁 園1

目的研究不同菱角殼不同溶劑的提取物的抗氧化能力。方法采用DPPH法分別測定二角菱角殼、四角菱角殼氯仿、乙酸乙酯、乙醇、水提取浸膏的抗氧化能力，同時與抗壞血酸、槲皮素、沒食子酸標準品進行了對比。結果用同一溶劑提取時，二角菱殼提取浸膏的 IC50值均高于四角菱殼提取浸膏；同一種菱角殼用不同溶劑提取時，其提取浸膏與標準品相比 IC50值為：氯仿浸膏＞水浸膏＞乙醇浸膏＞抗壞血酸＞乙酸乙酯浸膏≈槲皮素＞沒食子酸，即其清除 DPPH自由基能力的順序為：沒食子酸＞乙酸乙酯浸膏≈槲皮素＞抗壞血酸＞乙醇浸膏＞水浸膏＞氯仿浸膏。結論菱角殼具有較好的抗氧化能力。四角菱殼抗氧化能力強于二角菱殼，菱角殼乙酸乙酯提取部分清除DPPH自由基的能力最強。

氧自由基；DPPH；二角菱殼；四角菱殼

菱角為菱科植物菱或細果野菱的干燥果實[1]。前期的工作顯示，浙江產二角菱殼（Trapa bicornis Var.bispinosa）和湖南產四角菱殼（Trapa natans L.Var.incisa Makino）提取物對肺癌A549細胞具有較強的生長抑制作用[2]。誘發腫瘤的因素很多，現代研究表明，腫瘤的始發和促生階段具有氧自由基形成及出現細胞增殖水平的增高，因此清除氧自由基核抑制細胞增殖水平成為預防和治療腫瘤的一項措施[3]。DPPH自由基結構簡單、性質穩定、反應容易控制，是抗氧化劑自由基清除活性篩選的常用試劑；DPPH比色法也僅需要分光光度計，簡單、方便，實驗條件容易滿足[4]。本文以不同溶劑對上述菱角殼進行提取，研究提取物對DPPH自由基的清除能力，為菱角殼的抗癌藥理活性探索提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器UV-1750紫外可見分光光度計（島津儀器有限公司）；AL204型電子分析天平（梅特勒托利多公司）；FW135中藥材粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）。

1.2 材料菱角于2010年10月分別采于浙江和湖南，經中南林業大學生命科學院植物學教研室馬英姿副教授鑒定分別為菱科植物二角菱（Trapa bicornis Var.bispinosa）和四角菱（Trapa natans L.Var.incisa Makino）的干燥果實。標本存于湖南中醫藥大學藥學院中藥化學教研室。

1.3 試劑DPPH（1,1-二苯基-2-苦基苯肼自由基，日本和光純藥工業株式會社）；抗壞血酸、槲皮素、沒食子酸標準品（中國藥品生物制品檢定所）；其余試劑均為AR。

2 實驗方法

2.1 菱角殼提取浸膏制備稱取二角菱殼、四角菱殼藥材粗粉各33.7g、34.4g，用濾紙包好分別置于索氏提取器中，按極性由小到大的順序依次用氯仿、乙酸乙酯、乙醇、水，加熱回流提取3h。分別回收溶劑，水浴蒸干，干燥器內干燥 24h，得黑褐色浸膏，稱重，則得到 8個樣品即二角菱殼氯仿浸膏1.2g，四角菱殼氯仿浸膏 1.3g，二角菱殼乙酸乙酯浸膏5.5g，四角菱殼乙酸乙酯浸膏4.2g，二角菱殼乙醇浸膏7.6g，四角菱殼乙醇浸膏5.5g，二角菱殼水浸膏2.5g，四角菱殼水浸膏1.8g。

2.2 試液的制備

2.2.1 DPPH溶液的配制精密稱取DPPH10mg，溶于少量95%乙醇中，定容至250mL，即得濃度為0.04mg/mL 溶液，置于冰箱中冷藏備用。

2.2.2 對照品溶液的制備精密稱取抗壞血酸、槲皮素、沒食子酸對照品20.3mg、20.4mg、10.1mg，分別置于100mL容量瓶中，加入95%乙醇稀釋至刻度，搖勻，得 203μg/mL抗壞血酸對照品溶液、204μg/mL槲皮素對照品溶液、101μg/mL沒食子酸對照品溶液，再參考文獻，按2倍倍比稀釋分別得抗壞血酸、槲皮素、沒食子酸相應的8個不同濃度藥液。

2.2.3 供試品溶液制備精密稱取 2.1中制備的各樣品20.1mg、39.0mg、4.2mg、4.1mg、8.5mg、4.3mg、8.1mg、8.1mg，分別用相應溶劑溶解并定容至10mL，搖勻，得2.01、3.90、0.42、0.41、0.85、0.43、0.81、0.81mg/mL的第一濃度初始液，再按2倍倍比稀釋分別得樣品B1-B8相應的8個不同濃度藥液。

2.3 DPPH自由基穩定性實驗取濃度為203μg/mL的抗壞血酸和濃度為3.90mg/mL的樣品B1溶液，按照2.4.1項下方法加樣，每隔2 min測定吸光度值Ai，直到Ai值基本穩定。吸光度值Ai在加入抗氧化劑的最初20min內下降較快，在20～30min內，反應體系的Ai值變化緩慢，30min后Ai值基本保持不變。因此選擇測定菱殼提取浸膏與DPPH自由基的反應時間為30min。

2.4 清除DPPH能力的測定方法

2.4.1 清除率的測定參考文獻精密量取DPPH溶液2.5mL、對照品溶液和供試品溶液分別為0.5mL，于510nm處測定各吸光值（A），每一吸光值平行測定3次，按下公式計算DPPH自由基清除率：

2.4.2 半清除率的測定按 2.4.1下的操作步驟測定待測液DPPH自由基清除率，繪制DPPH自由基清除率對待測液濃度標準曲線，通過線性方程計算出DPPH自由基清除率為50%時所需對照品、不同菱角殼提取浸膏濃度，即IC50值。IC50值越低，DPPH自由基清除率達50%時所需抗氧化劑濃度越低，表明該抗氧化劑清除自由基的能力越強。

3 結果與討論

通過測定各抗氧化劑清除DPPH能力的指標為IC50值，其比較結果見下表1。

表1 抗氧化劑濃度與清除率關系

由表 1實驗結果可知，不同種類菱角殼用同一溶劑提取時，二角菱殼提取浸膏的 IC50值均高于四角菱殼提取浸膏，即四角菱殼提取浸膏清除DPPH自由基的能力強于二角菱殼提取浸膏；同一種菱角殼用不同溶劑提取時，其提取浸膏與標準品相比 IC50值為：氯仿浸膏＞水浸膏＞乙醇浸膏＞抗壞血酸＞乙酸乙酯浸膏≈槲皮素＞沒食子酸，即其清除 DPPH自由基能力的順序為：沒食子酸＞乙酸乙酯浸膏≈槲皮素＞抗壞血酸＞乙醇浸膏＞水浸膏＞氯仿浸膏，乙酸乙酯部分清除DPPH自由基的能力最強。表明菱角殼中主要的抗氧化活性成分溶于乙酸乙酯等極性溶劑中，其中的弱極性成分不具備良好的抗氧化能力，則奠定了以后的分離抗氧化活性單體實驗中以乙酸乙酯浸膏為主的基礎。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(2010年版一部)[M].北京：中國中醫出版社.附錄[III],2010.

[2] 伍茶花,丁揚州,裴剛,等.不同菱角殼提取物對肺癌A549細胞生長抑制研究[J].湖南中醫藥大學學報,2012,32(1)：27-30.

[3] 尹衛平,梁菊,吳文瀾.抗癌天然藥物研究進展[M].北京：科學出版社,2009.

[4] 寧杰,岳峰,巴媛媛,等.甜菊葉提取物清除DPPH 能力的研究[J].中國食品學報,2011,11(6)：27-34.

R917

A

1673-5846(2013)07-0225-02

1湖南中醫藥大學藥學院，湖南長沙 410208

2湖南中醫藥大學碩士研究生，湖南長沙 410208

湖南省教育廳資助項目(12C0272)；2011年度湖南中醫藥大學研究生科研創新項目課題資助；2012年度湖南中醫藥大學研究生創新性課題資助

袁園（1984-），女，碩士，助理實驗師；研究方向：中藥及其復方化學成分研究；E-mail：yykakashi@163.com，電話：13787208503。