電堆積毛細管電泳法檢測食品中四環(huán)素類抗生素殘留

邵鈺秀，余云娟，肖晶，陶香香，陳冠華

（江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇鎮(zhèn)江 212013）

電堆積毛細管電泳法檢測食品中四環(huán)素類抗生素殘留

邵鈺秀，余云娟，肖晶，陶香香，陳冠華

（江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇鎮(zhèn)江 212013）

建立了一種采用電堆積方式在線富集的毛細管電泳檢測牛奶、雞蛋和蜂蜜中（包括四環(huán)素、土霉素、強力霉素在內(nèi)）3種四環(huán)素類抗生素殘留的方法.對影響富集倍數(shù)和分離的主要因素進行了優(yōu)化.最佳運行緩沖液為20mmol／L的檸檬酸鹽溶液，pH為2.5，分離電壓20kV；進樣量25kV×30s.在優(yōu)化條件下，四環(huán)素、土霉素和強力霉素的富集倍數(shù)分別為86，54和54；檢出限為1.7～2.1，1.8～2.2和1.9～2.2μg／kg；定量下限均為20μg／kg，僅為歐盟標準中最大殘留限量的1／5（牛奶）和1／10（雞蛋）.方法可應用于雞蛋、牛奶和蜂蜜中3種四環(huán)素類抗生素殘留的檢測.

四環(huán)素類抗生素殘留；堆積；毛細管電泳

四環(huán)素類抗生素（tetracycline antibiotics，TCs）是由放線菌屬產(chǎn)生的一類廣譜抗生素，在化學結構上屬于氫化并四苯環(huán)衍生物，對革蘭氏陽性和陰性細菌、立克次氏體等均有抑菌作用，在禽畜生產(chǎn)中被廣泛作為治療藥物使用.當其作為飼料添加劑以mg／kg級的亞治療量應用于動物飼料中時，可以改善動物營養(yǎng)狀況，預防疾病，促進動物生長，提高養(yǎng)殖效益［1］.治療用藥后禁藥期控制不當或作為添加劑使用不當均可導致該類抗生素在動物性食品中的殘留超標.在蜂蜜生產(chǎn)過程中，TCs殘留主要是在治療蜜蜂幼蟲腐臭病時施用而產(chǎn)生的［2］.長期食用TCs殘留超標的動物性食品等同于服用低劑量的抗生素，會導致耐藥菌群的產(chǎn)生，造成嚴重后果.歐盟、美國和中國等均規(guī)定了TCs在動物源食品中的最大殘留限量［3］.

已報道的四環(huán)素類抗生素殘留的檢測方法包括高效液相色譜法［4］、微生物法［5］、薄層色譜法［6］和毛細管電泳法（CE）［7］等.在這些方法中，色譜類方法為防止復雜的樣品基質(zhì)對色譜柱的污染，通常需要較為費時的樣品凈化處理；微生物法的測試周期較長，并且定性較差.CE不需要為防止色譜柱污染而進行的樣品凈化處理，試劑消耗量極少，分離效率高.在藥物或藥物代謝樣品的檢測方面已有一些應用報道［8－10］.然而，由于CE中使用的毛細管極細，樣品承載量很小，采用紫外吸收檢測時，得到的檢出限難以滿足食品中藥物殘留分析的要求，故其在獸藥殘留檢測方面的應用受到限制.迄今，以CE方法檢測食品中TCs殘留只有少量報道［7，11－12］，都需要輔以固相萃取方法來增強檢出能力.

CE在線富集技術是解決其在痕量分析方面不足的一個發(fā)展方向.這類技術的一個共同特點是采用大進樣量，然后通過對分析物區(qū)帶的極大壓縮而大大提高其在區(qū)帶中的濃度，進而達到增強檢出能力的目的，在農(nóng)獸藥殘留分析中已有一些應用［13］.樣品堆積是在線富集技術的一種.該方法在毛細管區(qū)帶電泳的基礎上，利用低電導樣品中離子組分在高電導背景緩沖液界面上運動速度的突變實現(xiàn)對分析物的富集，尚無采用此法對TCs殘留進行檢測的報道，本文對利用此技術檢測食品中四環(huán)素（teracycline，TC）、土霉素（oxytertracycline，OTC）和強力霉素（doxycycline，DC）的殘留進行了研究.

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

CL1020毛細管電泳儀（北京彩陸科學儀器有限公司），配±30kV可調(diào)電源、紫外分光光度檢測器和HW－2000色譜工作站；未涂層熔融石英毛細管（邯鄲市鑫諾光纖色譜有限公司），75μm i.d.，總長60cm，有效柱長51cm；H－180超高速冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）；BS 124S電子分析天平（北京賽多利斯儀器有限公司）；pHS－2型酸度計（上海第二分析儀器廠）；B5500S－MT超聲清洗機（必能信超聲（上海）有限公司）.

TC，OTC，DC鹽酸鹽標準品購自Dr.Ehrenstorfer GmbH公司.檸檬酸、氫氧化鈉、鹽酸、乙腈、正己烷均為分析純，購于上海國藥化學試劑有限公司.牛奶、雞蛋和蜂蜜均購于鎮(zhèn)江某超市.純氮（體積分數(shù)為99.99%）購于鎮(zhèn)江氧氣廠.實驗用水為去離子水，電阻率182kΩ·m.

1.2 電泳條件

運行緩沖液為20mmol／L檸檬酸鹽溶液，用NaOH調(diào)pH為2.5.分離電壓20kV，電動進樣25kV× 30s，分離柱溫25℃，檢測波長275nm.

新用毛細管開始使用前，分別用甲醇沖洗10min，1mol／L鹽酸沖洗10min，1mol／L NaOH沖洗30min，0.1mol／L NaOH沖洗10min，緩沖液沖洗10min，每次之間都用水洗5min.每次開始實驗前用1mol／L NaOH、水和運行緩沖液分別沖洗5min，樣品間用0.1mol／L NaOH、水和運行緩沖液分別沖洗3min.

1.3 標準和樣品溶液制備

精密稱取適量TC，OTC，DC于燒杯中，分別用空白牛奶、雞蛋和蜂蜜的樣品溶液溶解并定容，得到3組質(zhì)量分數(shù)為20，100，500，1 000，2 000μg／kg的標準溶液系列.

精密稱取10.0g牛奶、雞蛋樣品于50mL離心管中，加入10.0mL水、20mL乙腈混合后超聲提取20min，以5 000r／min速度離心10min.取上清液，用5mL水、10mL乙腈重復提取，合并上清液于分液漏斗中，向分液漏斗中加入水飽和的正己烷（牛奶中不用加），振蕩搖勻3min，靜止后收集水層，將水層在40℃下旋轉濃縮至干.用水溶解并定容到1mL.

精密稱取10.0g蜂蜜，用溫水溶解于燒杯后轉移到50mL離心管中，以5 000r／min速度下離心10min，取上清液，在40℃下旋轉濃縮至干，用水溶解并定容至1mL.

2 結果與討論

2.1 電動進樣下的堆積過程原理

TCs為兩性化合物，在pH＜3.0的條件下為陽離子狀態(tài)［14］.在電動進樣之前，毛細管中充滿pH為2.5的運行緩沖液.在正向進樣電壓作用下，由于毛細管中的電滲流在pH為2.5時十分微小，運行緩沖液在進樣電場作用下運動十分緩慢，在進樣時間內(nèi)樣品溶液中的溶劑在電滲流作用下只能進入極窄的一個區(qū)帶.由于樣品溶液的電導率要遠小于運行緩沖液的電導率，在毛細管中，進樣電壓的絕大部分將分配在極窄的樣品區(qū)，這導致樣品區(qū)的電場強度遠大于運行緩沖液區(qū).于是，在正向進樣電壓作用下，樣品溶液中以陽離子形態(tài)存在的TC，OTC和DC在高場作用下快速電泳進入毛細管，當其穿越樣品和運行緩沖液界面時，由于進入低場區(qū)，其運動速度將立即降低，發(fā)生分析物離子在樣品與緩沖液界面處的堆積，由此實現(xiàn)了對分析物的在線富集.

2.2 分離影響參數(shù)的優(yōu)化

根據(jù)堆積過程原理，在適當?shù)倪M樣時間內(nèi)，分析物電動進入毛細管的區(qū)帶寬度是很窄的，并且位于毛細管的入口位置處.因此，這種進樣方式引入的樣品與直接正常壓力進樣方式引入的樣品區(qū)帶并無顯著差別，對分離條件的優(yōu)化可以按照正常壓力進樣方式進樣后的情況進行.在毛細管區(qū)帶電泳分離過程中，運行緩沖液的pH、電解質(zhì)濃度和分離電壓是影響分離的主要因素，需對此進行優(yōu)化.

在進樣量為1.46kPa×10s、分離電壓20kV和30mmol／L檸檬酸鹽的初始條件下，在pH 2.0～7.0內(nèi)考察了其對分離的影響.當pH≥4.5時，分析物在1h內(nèi)未出峰，這與TCs在pH 3.5～7.5內(nèi)為兩性離子［14］，表觀電泳淌度極小有關；當pH＜2.5時，OTC和DC重疊；在pH 2.5～4.0內(nèi)，3種分析物可基線分離，但是pH＞3.0，峰開始展寬，且遷移時間大大增加，這與其開始向兩性離子過渡有關.pH值對分離的影響如圖1所示.綜合考慮，在pH 2.5時，峰寬較小且遷移時間較短，峰高最高，此pH值被選定為最佳值.

圖1 pH對分離的影響Fig.1 Effect of pH on separation

緩沖液中電解質(zhì)的濃度直接影響到毛細管壁的Zeta電勢，使電滲流發(fā)生改變，同時對分析物的縱向擴散產(chǎn)生影響，最終影響到峰高和分離度.在優(yōu)化pH值下，進一步在15～50mmol／L內(nèi)考察檸檬酸鹽濃度對峰高和分離度的影響，發(fā)現(xiàn)在此濃度內(nèi)3種分析物均能達到基線分離，其中在20mmol／L的時候，峰高最大，故此為最優(yōu)濃度.

在上述優(yōu)化的緩沖液和1.46kPa×10s進樣量條件下，分別以10，15，17，20，25kV的分離電壓對3種分析物進行分離.隨著電壓的增大，遷移時間減小；但當電壓為25kV時，OTC和DC重疊嚴重；當電壓為20kV時，3種分析物能在20min內(nèi)出峰.綜合考慮分析速度和分離度，選擇分離電壓為20kV.

2.3 進樣量的優(yōu)化

在電動進樣條件下，分析物能夠通過電泳遷移被引入毛細管，但是在進樣電壓作用下，被引入的分析物也可以進行彼此間的分離.隨著進樣時間的不斷延長，雖然分析物能夠被更多地引入，但在進樣階段持續(xù)的分離過程時間也會越長，這等同于分析物分離前的原始區(qū)帶寬度加大，將導致分離后各分析物的峰寬加大，最終影響各組分的分離.因此，需要對進樣量進行優(yōu)化.在上述優(yōu)化的分離條件下，考察進樣量對峰高的影響，結果如圖2所示.從中可以看出，隨著進樣量A的加大，分析物的峰高h在不斷加大；但當進樣量超過750kV×s時，3種分析物不能達到基線分離.兼顧峰高和分離度，選擇進樣量為750kV×s，與此值相應的進樣量為25kV×30s.

圖2 進樣量對峰高的影響Fig.2 Effect of sample size on peak heights

2.4 富集倍數(shù)

采用上述優(yōu)化條件和進樣量分離質(zhì)量濃度為0.2mg／L的3種TCs混合標品，測得各自的峰面積為Si，以同樣的分離條件和1.46kPa×1s的進樣量，分離質(zhì)量濃度為50mg／L的3種TCs混合標品，測得各自的峰面積為si，則有富集倍數(shù)為fi＝（Si／si）×（50／0.2）.由此可計算出TC，OTC和DC的富集倍數(shù)分別為86，54和54倍.

2.5 方法驗證

在優(yōu)化條件下分別測定3種TCs的標準溶液系列（每個點3個平行），得到3種獸藥的校正曲線、線性范圍和相關系數(shù)r；平行測定9個空白樣品溶液，按3倍信噪比計算得到檢出限；以1mg／L樣品溶液平行測定9次，計算精密度RSD；結果見表1.

表1 校正曲線、線性范圍和精密度Tab.1 Calibration curves，linear dynamic ranges and precisions

按照優(yōu)化條件分別測定了市售牛奶、雞蛋和蜂蜜樣品中3種TCs的殘留，均未檢出；同時對每種樣品中每種獸藥進行了20，50和100μg／kg水平的加標回收率實驗，在每個濃度水平進行6次平行測定，得到的加標回收率如表2所示，標準和加標樣品的電泳圖如圖3所示.

圖3 標準溶液（A）和加標樣品（B）電泳Fig.3 Electropherograms of standard（A）and spiked sample（B）

表2 加標樣品回收率Tab.2 Calibration curves，linear dynamic ranges and precisions

3 結論

本研究建立的方法可以實現(xiàn)對TC，OTC和DC殘留的在線富集，富集倍數(shù)分別達到86，54和54倍.方法的定量下限僅為歐盟規(guī)定TC和OTC在牛奶中的最大殘留允許限量的1／5，在雞蛋中的1／10，而強力霉素在歐盟中規(guī)定在泌乳牛和產(chǎn)蛋雞中是禁止使用的.方法能夠用于牛奶、雞蛋和蜂蜜中這3種抗生素的殘留檢測.

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（責任編輯：梁俊紅）

Analysis of tetracycline antibiotic residues in food by capillary electrophoresis with stacking

SHAO Yuxiu，YU Yunjuan，XlAO Jing，TAO Xiangxiang，CHEN Guanhua
（College of Food and Bioengineering，Jiangsu University，Zhenjiang 212013，China）

The method of capillary electrophoresis with stacking was developed to determine the three tetracycline antibiotic residues including tetracycline，oxytetracycline and doxycycline in milk，egg and honey.The important parameters influencing enrichment factors and separation were optimized.The optimal running buffer was 20mmol／L citrate solution at pH 2.5.The separation voltage was 20kV.The sample size was 25kV×30s.Under the optimum conditions，the enrichment factors were 86，54and 54，and the limits of detection were 1.7-2.1μg／kg，1.8-2.2μg／kgand 1.9-2.2μg／kg for tetracycline，oxytetracycline and doxycycline，respectively.The limits of quantification were all 20μg／kg，which was only 1／5（milk）and 1／10（egg）of the maximum residual limits demanded by the regulation of European Union.The method can be applied to determine these three tetracycline antibiotic residues in milk，egg and honey.

tetracycline antibiotic residues；stacking；capillary electrophoresis

O657.8

A

1000－1565（2013）02－0161－06

10.3969／j.issn.1000－1565.2013.02.010

2012－12－20

教育部高等學校博士學科點專項科研基金（20093227110010）；江蘇高校優(yōu)勢學科建設工程資助項目第一作者：邵鈺秀（1987－），女，江蘇昆山人，江蘇大學在讀碩士研究生.

陳冠華（1956－ ），男，山西萬榮人，江蘇大學教授，博士生導師，從事食品安全檢測研究.E－mail：chengh＠ujs.edu.cn