中國明對蝦卵黃蛋白原基因啟動子克隆與分析

謝松，李理想，陳宏健，孫玲玲，柳峰松

（河北大學生命科學學院，河北省無脊椎動物系統(tǒng)學與應用實驗室，河北保定 071002）

中國明對蝦卵黃蛋白原基因啟動子克隆與分析

謝松，李理想，陳宏健，孫玲玲，柳峰松

（河北大學生命科學學院，河北省無脊椎動物系統(tǒng)學與應用實驗室，河北保定 071002）

為了探明中國明對蝦卵黃蛋白原基因啟動子表達調控機制，利用DNA步移法克隆了中國明對蝦卵黃蛋白原基因啟動子及其上游調控序列，總長1 100bp.分析表明，在基因轉錄起始位點上游－30～－24bp處有1個TATA box，未發(fā)現(xiàn)有CAAT box和GC box.同時，在上游調控區(qū)還存在有多個可能影響啟動子轉錄活性的順式作用元件，如NF－κB，YY1和SP1等轉錄因子結合位點.這些結果為深入研究中國明對蝦卵黃蛋白積累及卵子發(fā)生過程奠定了基礎.

卵黃蛋白原；DNA步移；啟動子；順式作用元件

卵黃是甲殼動物胚胎發(fā)生及早期幼體發(fā)育的主要營養(yǎng)物質.胚胎和開口前幼體發(fā)育、生長所需的能量和營養(yǎng)完全依賴卵黃.因此，卵黃含量和質量對于早期幼體維持生命是至關重要的.卵黃蛋白（vitellin，Vn）是一種高密度糖脂磷蛋白，是卵黃的主要成分.而卵黃蛋白原（vitellogenin，Vg）是Vn的前體，在肝胰腺或卵巢中合成，被卵母細胞攝取加工而成Vn.

雌性動物卵黃生成期可大量合成Vg，而在其他生活時期和雄性動物體內(nèi)的Vg含量卻很低.但后來人們又發(fā)現(xiàn)，雄性動物和幼年動物在人工雌激素或低劑量的類雌激素長期作用下，都能誘導體內(nèi)Vg的生成［1－2］.因此，通過檢測雄性卵生動物體內(nèi)Vg合成可以評價環(huán)境中的內(nèi)分泌干擾化合物（endocrine－disrupting chemicals，EDCs），也可用于環(huán)境內(nèi)分泌干擾物的篩選及環(huán)境毒理、污染調查等研究之中.例如，經(jīng)濟合作與發(fā)展組織（OECD）已經(jīng)將Vg作為環(huán)境雌激素化學物理想的暴露標志物［3］.幾種環(huán)境EDC檢測生物的Vg基因結構已經(jīng)被研究［1］.此外，Lee等（2008）克隆了日本虎斑猛水蚤（Tigriopus japonicus）Vg啟動子，發(fā)現(xiàn)其啟動子區(qū)不但含有雌性激素應答元件，還含有1個金屬應答元件，可以受到重金屬鎘的誘導調控.

目前已從多種甲殼動物體內(nèi)分離到Vn，并進行了生化性質研究.與其他甲殼動物Vn類似，中國明對蝦（Fenneropenaeus chinensis）Vn也是一種糖脂磷蛋白.本課題組已經(jīng)對中國明對蝦卵Vg基因的cDNA進行了克隆，實驗證實此基因在卵黃發(fā)生過程中的雌性對蝦肝胰腺和卵巢中特異性表達［4］，但其表達的調控的分子機制尚不清楚.

在產(chǎn)卵季節(jié)，中國明對蝦能在短短幾天之內(nèi)積累大量卵黃，說明Vg基因上具有1個非常強的啟動子，加上Vg基因表達關系到生殖發(fā)育等重要調控過程，所以Vg啟動子及其信號途徑的研究具有重要價值.本實驗通過DNA步移的方法克隆Vg基因5′端上游序列，并通過生物信息學方法對其進行分析，從而為探明Vg基因調控機制奠定了基礎.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料

購自于市場上的健康中國明對蝦.

1.1.2 生化試劑

DNA提取試劑盒為北京天根生化公司產(chǎn)品；Tag DNA聚合酶、平末端限制性內(nèi)切酶（EcoRⅤ，DraⅠ，AfaⅠ，PvuⅡ），pMD18－T載體等購自TaKaRa公司，DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒為北京康為生物科技公司產(chǎn)品，測序工作由南京金斯瑞生物技術公司完成.

1.2 方法

1.2.1 中國明對蝦基因組文庫的構建

利用DNA提取試劑盒提取明對蝦DNA，用質量濃度10g／L的瓊脂糖電泳檢測DNA的質量.分別用AfaⅠ，DraⅠ，EcoRⅤ和PvuⅡ4種平末端的限制性內(nèi)切酶消化，然后將消化產(chǎn)物分別與DNA接頭（Genome Walker Adaptor，如圖1）連接，即為中國明對蝦Genome Walker文庫.

圖1 接頭與接頭引物Fig.1 Structure of the Genome Walker adaptor and adaptor primers

1.2.2 Vg基因5′上游區(qū)的克隆

根據(jù)中國明對蝦Vg基因cDNA序列（GenBank：DQ354690.1）設計基因特異性反向引物R1和R2，同時根據(jù)接頭序列設計接頭引物AP1和AP2.以Genome Walker文庫為模板，AP1和R2為引物進行第1輪PCR，反應條件：94℃預變性4min；94℃變性30s，55℃退火40s，72℃延伸1min，35個循環(huán)；72℃最后延伸10min.然后，將擴增產(chǎn)物稀釋30倍作為模板，用引物AP2和R1進行第2輪PCR.第2輪PCR反應條件：94℃預變性4min；94℃變性30s，57℃退火40s，72℃延伸1min，35個循環(huán)；72℃最后延伸10min.最后，把回收片段連接pMD18－T載體，轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，經(jīng)PCR篩選陽性克隆后測序.

根據(jù)測序結果設計特異引物R3和R4.以DNA文庫為模板，以AP1和R3，AP2和R4為引物，進行2輪PCR，然后檢測，PCR產(chǎn)物回收，測序.

將這2次測序結果進行拼接，同時設計引物R5.以DNA文庫為模板，以AP1和R4，AP2和R5為引物進行PCR.DNA回收，測序.

將這3次測序結果進行拼接，同時設計引物F1和R6，以中國明對蝦DNA為模板進行克隆驗證，克隆產(chǎn)物回收，測序.實驗中所用引物見表1.

表1 PCR引物Tab.1 Primers for PCR

1.2.3 Vg基因啟動子及上游調控元件分析

對獲得的中國明對蝦Vg基因上游序列進行分析.利用網(wǎng)站http：／／www.fruitfly.org／seq＿tools／promoter.html上的NNPP程序和http：／／linux1.softberry.com／berry.phtml？topic＝tssg＆group＝programs＆subgroup＝promoter的TSSG程序進行轉錄起始位點以及核心啟動子位置預測.同時，綜合利用網(wǎng)站http：／／linux1.softberry.com／berry.phtml？topic＝nsite＆group＝programs＆subgroup＝promoter的在線程序Softberry和http：／／www.gene－regulation.com／cgi－bin／pub／programs／match／bin／files.cgi網(wǎng)站中的AliBaba 2.1，Match以及http：／／www.dna.affrc.go.jp／PLACE／signalup.html的SignalScan程序進行上游順式調控元件序列分析.

2 結果與分析

2.1 基因上游區(qū)序列克隆

根據(jù)中國明對蝦Vg基因cDNA序列設計反向引物，以Genome Walker文庫為模板，利用反向引物和接頭引物進行擴增，先后得到1個1 000bp和2個250bp的片段.將3次測序得到的序列拼接，并設計引物利用PCR驗證，最終得到1條1 185bp的Vg基因上游序列.

2.2 啟動子及調控序列分析

經(jīng)過分析發(fā)現(xiàn)，同大多數(shù)真核生物一樣，在預測的轉錄起始位點（＋1位）上游－30～－24bp的區(qū)域存在著1個典型的TATA box，但未發(fā)現(xiàn)GC box和CAAT box（圖2）.綜合多個網(wǎng)站的預測結果進行篩選可以看出，中國明對蝦Vg基因上游調控區(qū)含有多種潛在的順式作用元件，如SP1，YY1，NF－GMb，GHF1／Pit1，NF1，CDP以及NF－κB等轉錄因子結合元件（圖2）.

圖2 1.1kb的中國明對蝦卵黃蛋白基因組基因5′上游序列Fig.2 5′upstream fragment of the vitellogenin gene of Fenneropenaeus chinensis and containing the putative cis－regulatory elements in boxes

3 討論

迄今為止，有關甲殼動物Vn的研究多集中在卵黃蛋白原的合成部位，在外源刺激作用下卵黃蛋白原的合成途徑，卵黃蛋白原的結構特性，卵黃蛋白原的生物學功能以及卵黃蛋白原作為檢測環(huán)境激素的生物標志物的應用等幾個方面［5］.鑒于有關Vg基因表達調控機制的研究較為薄弱，本文對中國明對蝦卵Vg基因上游序列進行了克隆，并對啟動子及順式作用元件進行了一系列的生物信息學分析.

真核生物基因核心啟動子結構一般包含有TATA box，有的基因甚至有多個TATA box.而本課題組發(fā)現(xiàn)中國明對蝦Vg基因上游序列只有1個TATA box，其存在于轉錄起始位點上游－30～－24bp處，沒有找到典型的CAAT box和GC box，這種缺失可由轉錄因子來彌補.在所預測的核心啟動子上游，利用各種程序找到了多種潛在的順式作用元件，經(jīng)過篩選本課題組保留了SP1，YY1，NF－GMb，GHF1／Pit1，CDP以及NF－κB等轉錄因子的結合元件作為重點進行討論.

核因子SP1（Specificity Protein 1），屬于Sp／KLF家族成員，含有1個鋅指蛋白結構域，能直接結合DNA，對多種基因（如核酸代謝相關基因、氧化磷酸化相關基因等）均有調控作用［6］.它既可以正性調控基因轉錄，也可以對某些基因進行負性調控（包括P21、β類球蛋白基因等）［7－8］.此外，它還參與了細胞的生長和分化、調控細胞周期調控分子、生長相關信號轉導通路以及細胞凋亡等過程［9］.

轉錄因子YY1（yin－yang 1）也是一種至關重要的調控因子，它屬于GLI－Kruppel家族的鋅指蛋白，其作用元件廣泛存在于多個基因中，具有抑制和激活轉錄的雙重功能.例如，人們發(fā)現(xiàn)c－fos，loricrin，HDL－R等基因受到YY1的抑制作用，在c－Myc、核糖體蛋白L30基因中YYI起激活作用［10－11］.而Shi等（1991）曾發(fā)現(xiàn)，腺病毒E1A蛋白能將YY1從轉錄阻抑因子轉變成轉錄激活因子.此外，YY1也可以和其他因子共同發(fā)揮作用，1996年，Adrian等研究發(fā)現(xiàn)，轉錄因子SP1和YY1共同參與調控了人類轉鐵蛋白基因，轉錄因子SP1表現(xiàn)出促進作用，而YY1則顯現(xiàn)出抑制作用.

轉錄因子NF－GMb是冷休克蛋白結構域（cold－shock domain，CSD）蛋白家族成員，一般結合在上游序列靠近啟動子的地方.它能抑制一些基因轉錄如白細胞介素－1β（IL－1β），IL－2，IL－3，IL－8，腫瘤壞死因子－α（TNF－α），IL－2受體－α，干擾素－β（IFN－β），LD78，VCAM－1和ELAM－1等［12－13］，但是在一些外源物質（如聚丙烯酸甲酯）的刺激下能加強基因的轉錄水平.此外，轉錄因子NF－GMb還參與了調控組織再生、繁殖、胚胎發(fā)育、精子形成以及細胞凋亡等生理過程.

轉錄因子GHF1／Pit1也叫POU1F1（Pituitary－specific positive transcription factor 1），是一種生長激素基因激活因子，它在調控哺乳動物催乳激素及促甲狀腺激素等基因中起到重要的作用［14］.

CDP（CCAAT displacement protein）家族包含多個高度保守的同源蛋白，它們參與細胞的生長、分化和發(fā)育.作為一種反式作用因子，CDP往往結合在DNA上游區(qū)來抑制基因轉錄，也可以通過抑制其他轉錄因子（如NF－κB，AP－2等）的方式來抑制轉錄［15－16］.

核因子NF－κB是一種重要的調控因子，是由2個Rel蛋白單體組成的二聚物轉錄因子，能夠調控一系列參與細胞生理活動的基因，參與先天性和獲得性免疫應答、細胞調亡、炎癥、應激和淋巴形成等生理活動［17－19］.

近來，人們經(jīng)過多方面的研究發(fā)現(xiàn)Vg在生物體先天免疫中擔負著重要的作用，它作為一個多元的分子識別受體，能識別脂多糖、葡聚糖、肽聚糖、磷壁酸以及病毒等，具有殺菌、抗氧化等功能［20－21］.此外，它在免疫應答等方面也有重要的作用.通過本課題組的實驗可以看出在Vg基因上游存在多個與免疫相關的轉錄因子結合位點，這也有助于對Vn功能的研究.

本實驗克隆得到了中國明對蝦Vg基因上游調控序列，預測了一些可能與啟動子活性或者啟動子應答外源刺激有關的轉錄因子，同時對這些轉錄因子的功能進行了一些分析.但是，這些轉錄因子是否在Vg基因中發(fā)揮作用仍需進一步的實驗驗證.

甲殼動物能在短短幾天之內(nèi)積累大量卵黃，說明Vg基因上有1個非常強的啟動子.本課題組的實驗結果顯示，在Vg基因上游序列有多個可能增強啟動子功能的轉錄因子結合位點如NF－κB，YY1，SP1等，因此筆者推測在這些因子的共同作用下Vg基因啟動子活性大大增強，從而調控基因短時間內(nèi)大量合成Vn.在下一步的實驗中，會根據(jù)這些實驗結果對種種預測進行具體的驗證，來完善Vg基因啟動子調控模式，以便為其以后的應用提供理論支持.

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（責任編輯：趙藏賞）

Cloning and analysis of the promoter of Fenneropenaeus chinensis vitellogenin gene

XlE Song，Ll Lixiang，CHEN Hongjian，SUN Lingling，LlU Fengsong
（1.College of Life Sciences，Hebei University，Baoding 071002，China；2.Laboratory of Invertebrate Systematics and Application of Hebei Province，Baoding 071002，China）

In order to investigate the mechanism of the expression and regulation of the Fenneropenaeus chinensis vitellogenin gene，the promoter and the up－stream regulatory fragment of 1 100bp were amplified by Genome Walker method.Analysis showed that the“TATA box”was located at－30－24bp in the front of the transcription initiation site，but the“CAAT box”and“GC box”were absent.Meanwhile，among the upstream regulatory region，there were a few cis－acting elements which might affect the activity of promoter，such as NF－κB，YY1，SP1，and so on.These results laid the foundation for us to study the accumulation of the vitellin and the oogenesis of Fenneropenaeus chinensis in depth.

vitellogenin；Genome Walker；promoter；cis－actingelement

Q81

A

1000－1565（2013）02－0175－06

10.3969／j.issn.1000－1565.2013.02.012

2012－12－15

河北省自然科學基金資助項目（C2010000256，C2011201027）；教育部高等學校博士學科點專項科研基金資助項目（20101301120005）；河北大學自然科學基金資助項目（2011218）

謝松（1964－），男，江西尋烏人，河北大學教授，主要從事甲殼類營養(yǎng)與發(fā)育研究.

柳峰松（1976－），男，河北任丘人，河北大學教授，從事無脊椎動物分子免疫學研究.E－mail：liufengsong＠hbu.edu.cn