莠去津?qū)χ腥A絨螯蟹蛻皮激素分泌的影響

焦?jié)M靜，曹佳培，陳勤娜，劉蓓蓓，康現(xiàn)江

（河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北保定 071002）

莠去津?qū)χ腥A絨螯蟹蛻皮激素分泌的影響

焦?jié)M靜，曹佳培，陳勤娜，劉蓓蓓，康現(xiàn)江

（河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北保定 071002）

為了研究除草劑莠去津?qū)χ腥A絨螯蟹蛻皮激素分泌的影響，利用不同質(zhì)量濃度（0.001，0.01，0.1，1mg／L）的莠去津?qū)χ腥A絨螯蟹進(jìn)行染毒處理，采用酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)（ELISA）分析其對中華絨螯蟹血清蛻皮激素含量的影響.結(jié)果表明：低質(zhì)量濃度（0.001，0.01mg／L）以及高質(zhì)量濃度（1mg／L）莠去津暴露后，中華絨螯蟹血清中蛻皮激素含量相較對照組無顯著變化，而中間質(zhì)量濃度0.1mg／L的蛻皮激素含量則顯著低于對照組，該質(zhì)量濃度下中華絨螯蟹的蛻皮會受到一定的影響.

莠去津；中華絨螯蟹；蛻皮激素

莠去津（atrazine，ATR）是目前中國使用量較大的除草劑種類之一，其化學(xué)名稱2－氯－4－乙胺基－6－異丙胺基－1，3，5－三嗪，又名阿特拉津、莠去盡、阿特拉嗪、園保凈.ATR具有較大的極性，易被雨水淋洗至土壤較深層，造成地表水和地下水污染.作為一種內(nèi)分泌干擾物（endocrine－disrupting chemicals，EDCs），ATR對于人類和其他動物所造成的潛在的危害得到了廣泛而持久的關(guān)注［1］，對于十足目甲殼動物也做了一些研究探討［2－5］.

甲殼動物的生長蛻皮是一個復(fù)雜的激素調(diào)控過程，其中主要是由于眼柄中的X器官－竇腺復(fù)合體（X－organsinus gland complex，XO－SG）分泌的蛻皮抑制激素（molt inhibiting hormone，MIH）作用于Y器，調(diào)節(jié)Y器合成和分泌蛻皮激素（ecdyson），MIH和蛻皮激素間發(fā)生拮抗作用，共同調(diào)控甲殼動物的蛻皮過程［6］.

張志甫等［5］利用RT－PCR技術(shù)追蹤檢測了不同質(zhì)量濃度的ATR對中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）MIH表達(dá)的影響.本文在其基礎(chǔ)上，采用ELISA技術(shù)分析研究不同質(zhì)量濃度ATR暴露后，中華絨螯蟹血清中蛻皮激素含量的變化，初步闡明除草劑ATR對其蛻皮活動的影響，探討ATR對中華絨螯蟹生長發(fā)育的毒性作用.

1 材料與方法

1.1 材料

實驗用蟹于2010年3月、4月購自河北白洋淀，置于玻璃水族箱中暫養(yǎng)2周.選擇健壯且附肢齊全的個體進(jìn)行實驗.蟹體質(zhì)量為（12.07±0.51）g.

采用水體暴露方式對蟹進(jìn)行ATR染毒處理.以二甲亞砜（DMSO）作為ATR的助溶劑，助溶劑終體積分?jǐn)?shù)為0.01%［7］.設(shè)置0.001，0.01，0.1，1mg／L ATR處理組以及DMSO對照組，每組設(shè)置2個平行處理，每個處理20只蟹，雌雄各半.每2天換水1次，同時投入相應(yīng)質(zhì)量濃度的ATR，以保持整個處理過程中ATR質(zhì)量濃度不變.

實驗用水為經(jīng)充分曝氣、除氯的自來水（總硬度（以CaCO3計）230～240mg／L；pH 7.6～8.1），6L玻璃水族箱，暴露水體3L，自然水溫（14～18℃），自然光照，處理周期30d，期間投喂混合餌料并及時清除殘餌.

1.2 試劑及儀器

蟹蛻皮激素ELISA檢測試劑盒（RD公司）.Model 680型酶標(biāo)儀（BIO－RAD）；高速冷凍離心機.

1.3 方法

1.3.1 血清樣品的獲得

ATR處理30d后，取各處理質(zhì)量濃度的中華絨螯蟹，體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇溶液擦拭蟹體，剪斷步足（或用1mL／0.45mm一次性注射器從第3步足基部抽取）收集血淋巴，4℃靜置過夜.4℃，7 000r／min，離心15min.取上清液，分裝，每份60μL，－80℃保存?zhèn)溆?

1.3.2 血清蛻皮激素含量測定

采用雙抗體夾心ELISA測定血清中蛻皮激素含量.將已知蛻皮激素質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)品和未知質(zhì)量濃度的待測樣品加入預(yù)先包被了蟹蛻皮激素抗體的酶標(biāo)板反應(yīng)孔內(nèi)進(jìn)行檢測.37℃溫育，洗滌后，加入HRP標(biāo)記過的蛻皮激素抗體.再經(jīng)過溫育和洗滌，去除未結(jié)合的酶結(jié)合物，然后加入底物A，B，產(chǎn)生顏色，顏色的深淺和樣品中蛻皮激素的質(zhì)量濃度呈正相關(guān).經(jīng)終止液終止反應(yīng)，通過酶標(biāo)儀檢測OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品OD值和質(zhì)量濃度做出標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可得到待測樣品蛻皮激素的含量.

1.4 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析，多重比較采用LSD法，Excel 2003作圖.

2 結(jié)果與討論

采用ELISA技術(shù)檢測了不同質(zhì)量濃度ATR暴露30d后中華絨螯蟹血清中蛻皮激素含量的變化，發(fā)現(xiàn)僅0.1mg／L ATR質(zhì)量濃度組較助溶劑DMSO對照組有顯著變化（圖1）.

圖1 莠去津?qū)χ腥A絨螯蟹血清中蛻皮激素含量的影響Fig.1 Effects of atrazine on serum ecdysone in Eriocheir sinensis

由圖1可以看出，低質(zhì)量濃度0.001，0.01mg／L ATR處理組以及高質(zhì)量濃度1mg／L處理組暴露后，中華絨螯蟹血清中蛻皮激素含量和對照組的相比無顯著變化，而中間質(zhì)量濃度組0.1mg／L的蛻皮激素含量則顯著低于對照組（P＜0.01）.這一結(jié)果與張志甫等［5］研究的ATR對中華絨螯蟹MIH的影響結(jié)果基本相反.ATR對中華絨螯蟹蛻皮激素含量的影響存在劑量上的倒“U”形曲線效應(yīng).

張志甫等［5］利用RT－PCR技術(shù)，研究ATR同樣暴露30d后對中華絨螯蟹眼柄視上神經(jīng)節(jié)中MIH表達(dá)量的影響.2個高質(zhì)量濃度組（0.1mg／L和1mg／L）相比對照組均表現(xiàn)出了顯著的差異性，但是表現(xiàn)形式并不相同：0.1mg／L極顯著地提高了MIH的表達(dá)量，而1mg／L則對MIH的表達(dá)呈顯著抑制效應(yīng).針對這一結(jié)果，同時為了進(jìn)一步分析研究ATR對于中華絨螯蟹生長蛻皮的影響，本實驗考察了ATR作用后血清中蛻皮激素含量的變化，發(fā)現(xiàn)低質(zhì)量濃度和高質(zhì)量濃度組均未表現(xiàn)出毒性效應(yīng)，而中間質(zhì)量濃度組0.1mg／L則使蛻皮激素含量顯著降低，符合內(nèi)分泌干擾物倒“U”形劑量效應(yīng)規(guī)則.

內(nèi)分泌干擾物的作用機制非常復(fù)雜，經(jīng)典的毒理學(xué)規(guī)則“劑量決定毒性作用”有時并不適用于其毒性效應(yīng)，而U形和倒U形劑量效應(yīng)曲線在內(nèi)分泌干擾物的毒性效應(yīng)中是常見的表現(xiàn)形式［8－9］.所謂“U”形劑量效應(yīng)，就是最大效應(yīng)的出現(xiàn)發(fā)生于受試物的低質(zhì)量濃度和高質(zhì)量濃度暴露組，而非中間質(zhì)量濃度組；倒“U”形劑量效應(yīng)則相反，即中間質(zhì)量濃度暴露組較低質(zhì)量濃度和高質(zhì)量濃度造成的影響要明顯.當(dāng)然，這也引發(fā)了不少爭議，因為它畢竟與多年的對于毒物的毒性作用的認(rèn)識不同.然而Gore等［10］指出，對于內(nèi)分泌學(xué)來說這一現(xiàn)象不存在異議，因為這對于激素調(diào)控的內(nèi)分泌系統(tǒng)來說是非常普遍的現(xiàn)象.

結(jié)合張志甫等［5］的研究結(jié)果和本實驗的結(jié)果2部分內(nèi)容來看，0.1mg／L ATR使MIH表達(dá)量升高的同時也降低了蛻皮激素的含量.蛻皮激素由Y器官合成分泌，而這一過程受到眼柄視上神經(jīng)節(jié)XO－SG分泌的MIH調(diào)控，MIH通過降低胞內(nèi)第二信使cAMP的水平抑制Y器合成蛻皮激素［6］，實驗結(jié)果MIH表達(dá)量升高而蛻皮激素含量降低符合這一調(diào)控規(guī)律.

然而，1mg／L ATR對于中華絨螯蟹MIH（表達(dá)量顯著降低）［5］和蛻皮激素（含量與對照組無顯著差異）的影響值得思考，也就是說MIH的低表達(dá)并未觸發(fā)Y器蛻皮激素的合成.筆者推測既然甲殼動物蛻皮的內(nèi)分泌調(diào)控也是一個非常復(fù)雜的過程，其間涉及多種因素（如cAMP，Ca2＋，大顎器分泌的甲基法尼酯等）的共同調(diào)節(jié)［6］，那么ATR抑制MIH合成分泌的同時可能也影響到了其他因素在胞內(nèi)或血淋巴中的水平，這些因素間的互相制約調(diào)節(jié)抵消了MIH低表達(dá)對蛻皮激素合成的啟動作用，以至于未造成蛻皮激素的高表達(dá).

內(nèi)分泌干擾物對于甲殼動物生長蛻皮的影響方面已有很多研究，但作用機制并不相同.Zou等［11－12］發(fā)現(xiàn)外源雌激素可以顯著地抑制大西洋砂招潮蟹（Uca pugilator）表皮中幾丁質(zhì)酶的活性，而該酶是蛻皮前期消化幾丁質(zhì)外殼所必需的.因此，極有可能是這些外源雌激素封閉了表皮上的蛻皮激素受體，從而抑制其幾丁質(zhì)酶的活性而影響了蛻皮作用的發(fā)生.

同雌激素一樣，雄激素睪酮暴露也可以使大型溞Daphnia magna早期齡蟲蛻皮受到抑制，但是齡蟲體內(nèi)蛻皮激素周期變化水平并未因為睪酮暴露而改變，而是睪酮可以拮抗20－羥基蛻皮激素的作用，證明睪酮同樣是通過阻斷蛻皮激素受體引發(fā)蛻皮抑制作用的［13］.然而，農(nóng)業(yè)殺菌劑fenarimol存在不同的作用方式，它可直接造成蛻皮激素水平的降低而影響蛻皮［14］.

實驗結(jié)果顯示，ATR（0.1mg／L）對中華絨螯蟹生長蛻皮的影響，至少是因為ATR造成了眼柄視上神經(jīng)節(jié)中MIH表達(dá)量的升高［5］，從而引起蛻皮激素合成分泌量的降低，使蛻皮作用受到抑制.推測ATR對于中華絨螯蟹蛻皮的影響還會有其他原因，但需進(jìn)一步研究證實.

致謝：感謝穆淑梅老師在實驗設(shè)計和論文寫作過程中所做的貢獻(xiàn)；感謝張志甫同學(xué)在實驗材料染毒、養(yǎng)殖過程中所做的貢獻(xiàn).

［1］ HOTCHKISS A K，RIDER C V，BLYSTONE C R，et al.Fifteen years after“wingspread”environmental endocrine disrupters and human and wildlife health：Where we are today and where we need to go［J］.Toxicol Sci，2008，105（2）：235－259.

［2］ LI Kang，CHEN Liqiao，LI Erchao，et al.Acute toxicity of the pesticides chlorpyrifos and atrazine to the chinese mittenhanded crab，Eriocheir sinensis［J］.Bullet Environ Contam Toxicol，2006，77：918-924.

［3］ 穆淑梅，康現(xiàn)江，張志甫，等.莠去津慢性染毒對河蟹血淋巴細(xì)胞DNA的影響［J］.生態(tài)學(xué)雜志，2010，29（6）：1240－1244.

MU Shumei，KANG Xianjiang，ZHANG Zhifu，et al.Impacts of atrazine chronic poisoning on hemolymph DNA of Eriocheir sinensis［J］.Chinese Journal of Ecology，2010，29（6）：1240－1244.

［4］ 張晗，沈丹丹，穆淑梅，等.莠去津?qū)Υ菩匀毡菊游r的毒性作用［J］.河北大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2010，30（6）：701－705.

ZHANG Han，SHEN Dandan，MU Shumei，et al.Toxic effect of atrazine on female Macrobrachium nipponense［J］.Journal of Hebei University：Natural Science Edition，2010，30（6）：701－705.

［5］ 張志甫，穆淑梅，康現(xiàn)江，等.莠去津?qū)χ腥A絨螯蟹蛻皮抑制激素表達(dá)的影響［J］.水產(chǎn)科學(xué)，2011，30（4）：225－228.

ZHANG Zhifu，MU Shumei，KANG Xianjiang，et al.Effects of atrazine exposure on molt－inhibiting hormone expression in chinese mitten－h(huán)anded crab，Eriocheir sinensis［J］.Fisheries science，2011，30（4）：225－228.

［6］ RODRíGUEZ E M，MEDESANI D A，F(xiàn)INGERMAN M.Endocrine disruption in crustaceans due to pollutants：A review［J］.Comp Biochem Physiol A，2007，146：661－671.

［7］ 國家環(huán)境保護(hù)總局水和廢水監(jiān)測分析方法編委會.水和廢水監(jiān)測分析方法［M］.4版.北京：中國環(huán)境科學(xué)出版社，2002：727.

［8］ ROWE R I，BOUZAN C，NABILI S，et al.The response of trout and zebrafish embryos to low and high boron concentrations is U－shaped［J］.Biol Trace Elem Res，1998，66：261－270.

［9］ ALMSTRUP K，F(xiàn)ERNáNDEZ M，PETERSON J，et al.Dual effects of phytoestrogens result in U－shaped dose－response curves［J］.Environ Health Perspect，2002，110：743－748.

［10］ GORE A C，HEINDEL J J，ZOELLER R T.Endocrine disruption for endocrinologists（and others）［J］.Endocrinology，2006，147（S）：1－3.

［11］ ZOU E，F(xiàn)INGERMAN M.Effects of exposure to diethyl phthalate，4－（tert）－octylphenol，and 2，4，5－trichlorobiphenyl on activity of chitiobiase in the epidermis and hepatopancreas of the fiddler crab，Uca pugilator［J］.Comp Biochem Physiol C，1999，122：115－120.

［12］ ZOU E，F(xiàn)INGERMAN M.Effects of estrogenic agents on chitiobiase activity in the epidermis and hepatopancreas of the fiddler crab，Uca pugilator［J］.Ecotoxicol Environ Saf，1999，42：185－190.

［13］ MU X，LEBLANC G A.Developmental toxicity of testosterone in the crustacean Daphnia magnainvolves anti－ecydsteroidal activity［J］.Gen Comp Endocrinol，2002，129：127－133.

［14］ MU X，LEBLANC G A.Environmental antiecdysteroids alter embryo development in the crustacean Daphnia magna［J］.J Exp Zool，2002，293：287－292.

（責(zé)任編輯：趙藏賞）

Effects of atrazine on ecdyson secretion in Eriocheir sinensis

JlAO Manjing，CAO Jiapei，CHEN Qinna，LlU Beibei，KANG Xianjiang
（College of Life Sciences，Hebei University，Baoding 071002，China）

In order to investigate the effects of atrazine on ecdyson secretion in Eriocheir sinensis，the crab was treated with 0.001，0.01，0.1，1mg／L of atrazine，and the mass concentration of ecdyson in the serum was measured by ELISA.The result showed that at relatively lower and higher doses（0.001，0.01，1mg／L），atrazine did not show any significant differences with the control groups；but at the middle concentration（0.1mg／L），the herbicide could significantly decrease ecdyson level in serum of the crab.That maybe affects the molt of E.sinensis.

atrazine；Eriocheir sinensis；ecdyson

X 503.225；Q 959.223

A

1000－1565（2013）02－0181－04

10.3969／j.issn.1000－1565.2013.02.013

2012－09－10

國家自然科學(xué)基金資助項目（31202000，31272309）；河北省自然科學(xué)基金資助項目（C2011201028）；河北大學(xué)博

士基金資助項目（2012－239）；保定市科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展計劃項目（10ZN008）

焦?jié)M靜（1986－），女，河北涿州人，河北大學(xué)在讀碩士研究生.

康現(xiàn)江（1964－），男，河北邯鄲人，河北大學(xué)教授，博士生導(dǎo)師，主要從事細(xì)胞發(fā)育分化及其調(diào)控方面的研究.

E－mail：xjkang＠hbu.edu.cn