劉芳容,王強,張靜,趙欣,3
(1.重慶市腫瘤醫院婦瘤科,重慶 400030;2.重慶第二師范學院生物與化學工程系,重慶 400067;3.釜山國立大學食品科學與營養學科,韓國釜山 609-735)
苦丁茶對MCF-7人乳腺癌細胞的體外抗癌效果
劉芳容1,王強2,張靜1,趙欣2,3
(1.重慶市腫瘤醫院婦瘤科,重慶 400030;2.重慶第二師范學院生物與化學工程系,重慶 400067;3.釜山國立大學食品科學與營養學科,韓國釜山 609-735)
對市售的苦丁茶進行MCF-7人乳腺癌細胞體外抗癌效果和體內抗轉移效果評價.通過MTT實驗、DAPI熒光染色分析和RT-PCR分析說明其體外抗癌效果.200μg/mL苦丁茶(81%抑制率)水提物表現出對MCF-7人乳腺癌細胞較強的生長抑制效果.200μg/mL比100和50μg/mL苦丁茶水提物具有更強的細胞誘導凋亡效果,Bax,caspase-3和caspase-9的mRNA表達得到增強,Bcl-2表達減弱.苦丁茶水提物處理后炎癥相關因子NF-κB,iNOS和COX-2表達減弱,展示了苦丁茶的抗炎特性.由此得出,一定質量濃度的苦丁茶具有良好的抗癌預防效果.
苦丁茶;MCF-7人乳腺癌細胞;抗癌
苦丁茶(Ilex kudingcha Tseng)是野生冬青科冬青屬常綠喬木,俗稱茶丁、富丁茶、皋盧茶,是中國南方地區經常飲用的一類茶,是傳統的藥用植物[1].苦丁茶作為傳統飲品和藥用植物,在傳統醫學上具有清熱消暑、明目益智、生津止渴、利尿強心、潤喉止咳、降壓減肥、抑癌防癌、抗衰老、活血脈等多種功效,是一種很好的醫藥保健飲料[2].
苦丁茶中含有豐富的水提物,包括多酚類物質、氨基酸,胡蘿卜素和維生素等,由于這些功能性成分的存在,在近年的研究中已經表明苦丁茶具有抗菌消炎、調節心血管、生殖和免疫系統的功效[3-5].此外,還有研究表明苦丁茶對胃癌患者化療后靜脈炎有預防和治療作用[6],并且還可以誘導鼻咽癌細胞凋亡,起到抗癌效果[].
乳腺癌是女性排名第一的常見惡性腫瘤,惡性腫瘤與一些標志物有關[8],惡性腫瘤細胞到達其他部位繼續生長發生腫瘤轉移從而危及病患生命,因此減少癌細胞增殖和防止腫瘤轉移是癌癥治療的途徑,除了醫學的治療手段外,通過堅持食用保健食品預防和幫助治療乳腺癌已經得到證實[9].為了驗證苦丁茶的抗癌效果,本研究初步驗證苦丁茶對MCF-7人乳腺癌細胞(MCF-7human breast adenocarcinoma cells)體外抗癌功能性作用和利用小鼠動物模型進行苦丁茶的抗腫瘤轉移的研究.
1.1 樣品準備
苦丁茶:市售苦丁茶,進行冷凍干燥后用沸水3次提取后使用旋轉蒸發儀(R-114,瑞士Buchi公司)蒸干后得到水提物,將提取物用二甲基亞砜(DMSO,日本純正化學公司)溶解后待用.
1.2 癌細胞株培養
MCF-7人乳腺癌細胞購自ATCC(美國典型培養物保藏中心,美國).癌細胞在加有體積分數10%的胎牛血清(FBC)和體積分數1%的青霉素-鏈霉素溶液RPMI 1640培養基(美國GIBCO公司)中置于含體積分數為5%二氧化碳的培養箱(MCO96,日本三洋電機公司)中培養.每周更換2~3次培養基,6~7d傳代1次.
1.3 4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)熒光染色法觀察癌細胞凋亡情況
MCF-7人乳腺癌細胞培養24h后,加入不同質量濃度苦丁茶水提取物樣品后再培養48h,癌細胞用體積分數為0.05%脻蛋白酶-0.02%乙二胺四乙酸(美國GIBCO公司)消化后,再用PBS洗后使用體積分數為3.7%的多聚甲醇(paraformaldehyde,美國Sigma公司)常溫下用10min進行細胞固定,然后用質量濃度為1μg/mL的4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI,美國Sigma公司)溶液染色10min.最后用PBS溶液漂洗染色后的細胞2次,熒光顯微鏡下(BXSO,日本奧林巴斯公司)進行形態學觀察并拍照分析[10].
1.4 3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑嗅(MTT)法檢測癌細胞抑制效果
將培養的MCF-7人乳腺癌細胞稀釋在培養基中并按1×104mL-1接種在96孔培養板上,每孔加入180μL含癌細胞的培養基.在二氧化碳培養箱中培養24h.實驗時,每個樣品設3個劑量組,質量濃度分別為50,100,200μg/mL,細胞貼壁后每孔加入不同質量濃度的20μL苦丁茶水提物.加入樣品繼續培養48h后,每孔加入5mg/mL的MTT試劑20μL,再置于二氧化碳培養箱中培養4h后,將各孔內上清液棄去,按每孔150μL加入二甲基亞砜后震蕩30min,用酶標儀(Elx800,美國Bio Tekinstruments公司)在540nm波長下測定各孔OD值,并按公式(抑制率=[(空白孔OD值-樣品孔OD值)/空白孔OD值]×100%)計算細胞增殖抑制率[11-12].
1.5 Reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR)分析
用DAPI分析法相同的程序準備一定量的苦丁茶水提物處理后的MCF-7人乳腺癌細胞,用RNAzol試劑(美國Invitrogen公司)提取癌細胞中的總RNA.將分離的RNA定量后,以oligo dT為引物,在AMV逆轉錄酶作用下制備ss cDNA,再以制備好的cDNA為模板,用RT-PCR法擴增凋亡基因Bax,Bcl-2,caspase-3,caspase-9和炎癥基因NF-κB,IκB-α,iNOS,COX-2(表1).glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase(GAPDH)持家基因作為內參照標準.然后按每mL瓊脂液中加入0.05μL溴化乙錠配制的質量分數為1%的瓊脂電泳檢查PCR擴增產物[13-14].

表1 RT-PCR引物序列Tab.1 Primers of RT-PCR
1.6 數據處理
根據3次獨立實驗結果,數據表示為x±SD,數據分析運用SAS v9.1統計學軟件采取Duncan's multiple range tests,P<0.05有顯著性差異.
2.1 苦丁茶誘發MCF-7人乳腺癌細胞凋亡效果的形態觀察
DAPI細胞染色后,凋亡細胞核能發出藍色熒光,據此可以判斷細胞是否凋亡.對照組MCF-7細胞染色后細胞核邊緣清晰、著色均勻.經不同質量濃度苦丁茶水提物處理后的癌細胞均出現細胞邊緣不規則、細胞核濃染、凋亡小體等典型的細胞凋亡現象,而200μg/mL苦丁茶水提物作用后最為明顯(圖1).可見苦丁茶對誘導癌細胞凋亡具有一定的效果,并且質量濃度越高作用越明顯.

圖1 苦丁茶水提物對MCF-7人乳腺癌細胞凋亡效果Fig.1 Apoptotic effect of Ilex kudingcha Tseng water extract on MCF-7human breast adenocarcinoma cells
2.2 苦丁茶對MCF-7人乳腺癌細胞體外增殖的抑制效果
采用MTT法,檢測苦丁茶對MCF-7細胞的體外抗癌效果.結果顯示,苦丁茶水提取物對MCF-7細胞具有一定的抑制作用,且抑制效果隨樣品質量濃度增加呈梯度增加.以200μg/mL的苦丁茶水提物處理MCF-7細胞時,表現出很強的抑制率(81%).以100,50μg/mL的苦丁茶水提物處理MCF-7細胞時,癌細胞生長抑制率為58%和19%(表2).由此可見,苦丁茶對MCF-7人乳腺癌細胞具有抑制增殖效果,濃度越高抑制效果越顯著.

表2 MTT法測定苦丁茶水提物對MCF-7人乳腺癌細胞的生長抑制效果Tab.2 Inhibition of the growth of MCF-7human breast adenocarcinoma cells by Ilex kudingcha Tseng water extract as evaluated by a MTT assay
2.3 苦丁茶對MCF-7人乳腺癌細胞的Bax和Bcl-2基因的mRNA表達影響
以不同質量濃度的苦丁茶水提取物處理MCF-7人乳腺癌細胞,以200μg/mL質量濃度水提物處理過的MCF-7人乳腺癌細胞Bax表達最強,以100和50μg/mL質量濃度處理過的MCF-7人乳腺癌細胞中Bax表達呈現遞減的趨勢;Bal-2的mRNA表達中,經不同質量濃度苦丁茶水提物處理后,隨著質量濃度的升高表達減弱(圖2).

圖2 經苦丁茶水提物處理后MCF-7人乳腺癌細胞的Bax和Bcl-2的mRNA表達Fig.2 Effects of Ilex kudingcha Tseng water extract on the mRNA expression of Bax and Bcl-2in MCF-7human breast adenocarcioma cells
2.4 苦丁茶對MCF-7人乳腺癌細胞的caspase-3和caspase-9基因的mRNA表達影響
以苦丁茶水提取物處理MCF-7人乳腺癌細胞,觀察癌細胞的caspase-3和caspase-9表達,得到與Bax表達相似的結果,隨著處理細胞樣品質量濃度的增加caspase-3和caspase-9也隨之增加,200μg/mL質量濃度處理時,表達最強(圖3).由此可以看出,在200μg/mL質量濃度處理下苦丁茶對MCF-7人乳腺癌細胞的凋亡作用強于其他質量濃度.

圖3 經苦丁茶水提物處理后MCF-7人乳腺癌細胞的caspase-3和caspase-9的mRNA表達Fig.3 Effects of Ilex kudingcha Tseng water extract on the mRNA expression of caspase-3and caspase-9 in MCF-7human breast adenocarcinoma cells
2.5 苦丁茶對MCF-7人乳腺癌細胞的NF-κB和IκB-α基因的mRNA表達影響
通過苦丁茶水提取物處理MCF-7人乳腺癌細胞觀察苦丁茶的抗炎效果,以200μg/mL質量濃度處理過的MCF-7人乳腺癌細胞NF-κB表達最弱,以100和50μg/mL質量濃度處理過的MCF-7人乳腺癌細胞中Bax表達呈現隨質量濃度減小表達增加的趨勢;IκB-α的mRNA表達中,經不同質量濃度樣品處理后,表現出與NF-κB表達相反的趨勢,隨著質量濃度的升高表達增加(圖4).

圖4 經苦丁茶水提物處理后MCF-7人乳腺癌細胞的NF-κB和IκB-α的mRNA表達Fig.4 Effects of Ilex kudingcha Tseng water extract on the mRNA expression of NF-κB and IκB-αin MCF-7human breast adenocarcinoma cells
2.6 苦丁茶對MCF-7人乳腺癌細胞的iNOS和COX-2基因的mRNA表達影響
以苦丁茶水提取物處理MCF-7人乳腺癌細胞,觀察癌細胞炎癥相關因子iNOS和COX-2,發現隨著處理細胞樣品質量濃度的增加表達隨之減弱,200μg/mL質量濃度處理時,表達最弱,100和50μg/mL質量濃度處理的細胞表達也弱于沒有經過樣品處理過的對照細胞(圖5).由此可以看出,經苦丁茶水提物處理過的MCF-7人乳腺癌細胞的抗炎作用強于未經處理的癌細胞,并且隨苦丁茶水提物質量濃度的增加,抗炎效果也增加.

圖5 經苦丁茶水提物處理后MCF-7人乳腺癌細胞的iNOS和COX-2的mRNA表達Fig.5 Effects of Ilex kudingcha Tseng water extract on the mRNA expression of iNOS and COX-2in MCF-7human breast adenocarcinoma cells
苦丁茶作為一種保健茶葉飲品,其部分功能已經得到證實.對癌細胞增值的體外作用可以從一定程度上證明保健食品的癌預防效果.本文中隨著苦丁茶樣品質量濃度的增加MCF-7人乳腺癌細胞的增值減少,證明苦丁茶可以明顯地在體外抑制癌細胞的生長.細胞凋亡是在生理或病理條件下,由基因調控的細胞主動程序化死亡的過程[15].在癌癥發生過程中凋亡相關基因的突變或表達異常可以阻斷癌細胞的凋亡,促使癌癥發生[16].Bcl-2基因是一種原癌基因,它具有抑制凋亡的作用.Bcl-2可與促凋亡Bax形成二聚體,Bax相對量高于Bcl-2時,Bax同二聚體的數量增多,從而促進細胞死亡[17].本研究中隨著處理癌細胞的苦丁茶水提物質量濃度的增加,癌細胞的Bax表達加強,Bcl表達減弱,可以認為苦丁茶能促進癌細胞的凋亡,從而起到對乳腺癌的預防作用.Caspase基因選擇性地切割某些蛋白質,從而造成細胞凋亡,caspase-9為凋亡途徑的上游caspase,caspase-3為下游caspase,caspase-9作為啟動性caspase,隨著表達的加強可以加強對下游caspase-3的激活,caspase-3可直接降解胞內的結構蛋白和功能蛋白,引起凋亡[18].由此可以看出苦丁茶對癌細胞的caspase-3和9的作用是可促進癌細胞凋亡.腫瘤轉移是指惡性腫瘤細胞離開原發部位,通過血液、淋巴運轉或直接播散到不連續的組織器官中繼續生長,形成與原發腫瘤病理類型相同的腫瘤[19].COX-2,iNOS是啟動子區域含NF-kB結合位點的2種誘生型酶,三者之間存在著密切的關系.NF-kB作為一種重要的多向性核轉錄因子,它調控著多種基因的表達,并參與免疫反應、炎癥反應、細胞凋亡、腫瘤發生等多種生物學過程.環氧合酶-2(COX-2)和誘導型一氧化氮合酶(iNOS)為2種誘生型酶,在大多數組織中不表達,但在一些炎癥性細胞因子、生長因子、內毒素及促癌劑等的作用下呈現高表達狀態,從而發揮其病理作用[20-21].苦丁茶富含具有抗氧化、清除自由基的維生素C、維生素E和生物類黃酮等生物活性物質,能削弱自由基對人體的危害,增加肌體免疫力,具有防癌抗癌的作用.苦丁茶還含有多種人體必需的微量元素,其中硒具有抗氧化、抗病毒、抗癌作用[22].特別是苦丁茶含有的類黃酮物質可能是抗癌功效最強的成分,這些類黃酮物質通過抗氧化、自由基清除和對二價陰離子的螯合作用實現抗氧化和抗癌作用[23].本文對苦丁茶進行了體外抗癌效能的比較實驗,得出苦丁茶具有抗癌效果的結果.苦丁茶對人體的臨床作用有待更深層次的研究.
參 考 文 獻:
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(責任編輯:趙藏賞)
In Vitro anticancer effect of Ilex kudingcha Tseng in MCF-7 human breast adenocarcinoma cells
LlU Fangrong1,WANG Qiang2,ZHANG Jing1,ZHAO Xin2,3
(1.Department of Gynecologic Oncology,Chongqing Cancer Hospital,Chongqing 400030,China;2.Department of Biological and Chemical Engineering,Chongqing University of Education,Chongqing 400067,China;3.Department of Food Science and Nutrition,Pusan National University,Busan 609-735,Republic of Korea)
One Ilex kudingcha Tseng product was purchased for the evaluation of in vitro anticancer effect in MCF-7human breast adenocarcinoma cells and in vivo anti-metastatic effect.In MTT assay,apoptosis analysis by DAPI staining and RT-PCR,western blot gene expressions were employed to check their in vitro anticancer effect and in vivo anti-metastatic effect were measured using a animal model.At the mass concentration of 200μg/mL,I.kudingcha Tseng water extract(81%inhibitory rate)showed the best inhibitory effect on the growth of MCF-7human breast adenocarcinoma cells.I.kudingcha Tseng water extract(200μg/mL)significantly induced apoptosis,up-regulated mRNA expressions of Bax,caspase-3and caspase-9,and down-regulated Bcl-2expression,compard with 100and 50μg/mL of I.kudingcha Tseng water extract.The expression of genes associated with inflammation,NF-κB,iNOS,andCOX-2was significantly downregulated by I.kudingcha Tseng,demonstrationg its anti-inflammatory properties.These results suggest that I.kudingcha Tseng showed good cancer preventive effect.
Ilex kudingcha Tseng;MCF-7human breast adenocarcinoma cells;anticancer
Q813
A
1000-1565(2013)02-0185-08
10.3969/j.issn.1000-1565.2013.02.014
2012-09-12
重慶市自然科學基金資助項目(CSTC2012jjA80002);重慶教委科學技術研究項目(KJ121504)
劉芳容(1972-),女,重慶人,重慶市腫瘤醫院主管護師,主要從事腫瘤護理研究.
趙欣(1981-),男,蒙古族,重慶人,重慶第二師范學院講師,主要從事保健食品抗癌功能性研究.E-mail:foods@live.cn