沙鼠前腦缺血再灌注損傷后腦組織HSP27和IGF－1的表達變化

程 坤，胡治平

腦功能在缺血再灌注（I／R）后出現嚴重的障礙，稱之為腦缺血再灌注損傷。腦缺血再灌注損傷是多種因素相互作用的結果［1］，其機制可能包括：自由基生成增多、內皮細胞黏附分子的表達、細胞內鈣離子超載、前列腺素增高、蛋白酶的激活、細胞因子產生增加和興奮性氨基酸釋放過度等諸因素。近些年來，關于小熱休克蛋白（small heat shock protein，sHSP）和胰島素樣生長因子－1（insulin－like growth factor，IGF－1）與腦缺血性損傷的研究日益受到關注。

1 材料與方法

1.1 動物分組及模型建立 將北京動物實驗研究中心提供的健康雄性蒙古沙鼠（體重90g±10g），隨機分為正常對照組、假手術組、I／R6h組、I／R1d組、I／R3d組、I／R7d組。對于I／R組用戊巴比妥（30mg／kg）腹腔麻醉后，迅速分離并暴露雙側的頸總動脈，夾閉10min后恢復血流，然后按照分組于6h、1d、3 d、7d后斷頭處死動物。

1.2 主要試劑 北京中杉金橋生物技術有限公司提供的HSP27和IGF－1兔多克隆抗體，SP免疫組織化學試劑盒以及DAB顯色試劑盒。

1.3 病理變化、免疫組織化學染色法的觀察 行常規HE染色，用光學顯微鏡觀察海馬CA1區的病理變化。采用免疫組織化學SP法檢測腦組織中HSP27、IGF－1的表達，陽性為細胞質見棕褐色細顆粒。

1.4 統計學處理 實驗數據以均數±標準差（x±s）表示，采用LSD－t檢驗法、直線相關分析法；統計分析使用SPSS Ver.15.0軟件完成。

2 結 果

2.1 病理觀察結果 隨再灌注時間延長可見膠質細胞和細胞間質水腫、肥大、增生，神經元壞死，以缺血再灌注3d、7d組損傷較重。

2.2 免疫組化結果 陽性為細胞質見棕褐色細顆粒，在正常對照組及假手術組差異無統計學意義（P＞0.05），兩組前腦皮質神經元、神經膠質細胞中HSP 2 7和IGF－1有少量表達。在I／R6h組HSP27和IGF－1的表達開始增加，與假手術組比較差異有統計學意義（P＜0.05）；I／R3d組呈強陽性反應，表達達到高峰；與假手術組比較差異有統計學意義（P＜0.05）；I／R7d組表達雖較前減少，但仍高于假手術組（P＜0.05）。I／R各組間表達差異有統計學意義（P＜0.05）。在相同誘發條件下，HSP27和IGF－1在前腦皮質神經元、神經膠質細胞中的表達一致，直線相關分析表明表達呈正相關（r＝0.848，P＜0.05）。詳見表1。

表1 各組Hsp 27和IGF－1陽性細胞數表達（x±s）

3 討 論

HSP27是在哺乳動物中發現的分子量為27kD的小熱休克蛋白。在生理情況下HSP27主要以組成型即非磷酸化形式在腦干和脊髓細胞胞漿中表達，腦皮質細胞中有少量表達［2］。HSP27在神經細胞處于缺血缺氧狀態、癲癇發作、過高體溫等應激狀況時被誘導，在絲氨酸位點上磷酸化，形成磷酸化的異構體，在腦皮質細胞中表達增加，從而發揮其分子伴侶細胞保護作用。

Kazuhiko等［3］研究表明缺血再灌注1，HSP27在沙鼠海馬齒狀回的表達開始增加，至2d～4d達到高峰；而如果夾閉時間延長至6分～8.5分，則還可見CAI區表達HSP27。本實驗與上述的實驗結果相似。可能的原因是：一些有害細胞因子在缺血再灌注后其表達開始上調，從而激活轉錄因子HSF，與HSE結合并啟動HSP27的基因，從而使磷酸化的HSP27表達上調［4］，并發揮其分子伴侶、抑制細胞凋亡、抗炎等細胞保護作用。

IGF－1是一類廣泛存在于機體多種組織中的小分子蛋白多肽，分子量約為7 500kD，IGF－1在腦組織中廣泛分布。IGF－1主要以與胰島素樣生長因子結合蛋白（IGFBPs）結合存在，游離IGF－1與結合IGF－1可以互相轉化。IGF－1的大部分細胞效應是通過IGF－1受體實現的［5］。IGF－1在正常腦組織可促進正常生長和腦的發育。一些研究表明，IGF－1內源性水平被上調在缺血再灌注的腦組織中，從而調節內源性的修復和保護機制［6］。

Hwang等［7］觀察到腦缺血早期（1 2h～2 4h）內源性IGF–1在海馬、齒狀回神經元和膠質細胞表達增加，且與抑制遲發性神經細胞死亡有關。在本實驗得出一致的結論。IGF－1保護缺血性腦損傷的可能機制有：降低腦血管阻力、抑制神經細胞凋亡、對抗興奮性氨基酸毒性、防止細胞的鈣超載、調節一氧化氮合酶活性等［6］。此外在缺血性腦損傷中IGF－1的合成增多，還參與神經元的修復和再生。

HSP27與IGF－1在腦缺血再灌注損傷中的關系國內外尚無研究。李旺輝［8］觀察到，在注入IGF－1組缺血再灌注SD大鼠，HE染色顯示神經細胞壞死程度明顯減輕，用免疫組化顯示其腦組織HSP70表達明顯增加。推測IGF－1在腦缺血再灌注損傷中通過增加HSP70蛋白的表達而起保護作用。余國偉等［9］的實驗表明在低溫保存液中添加IGF－1可明顯降低心肌細胞凋亡的發生，促進再灌注期心功能的恢復。IGF－1的心肌保護機制可能與HSP90依賴性Akt激活和線粒體轉位有關。Shan等［10］觀察到，HSP60在缺血再灌注的心肌細胞中的表達增加，HSP60可能抑制IGF－1的降解，增大其抗凋亡的作用。

本實驗觀察到HSP27和IGF－1在相同誘發條件下，其表達具有空間定位一致、時間變化趨勢相似的特點。表明在沙鼠腦缺血再灌注損傷中HSP27與IGF－1發揮相互協同腦保護作用。作用包括兩方面：一則在缺血再灌注時機體產生應答，從而HSP27表達增加，利用其分子伴侶功能，幫助IGF－1折疊及移位，防止其聚集，抑制其降解，還可以幫助變性的IGF－1解聚及復性，從而發揮細胞保護作用；另則在缺血再灌注后IGF－1可上調HSP27在腦組織中的表達，機制可能為p38MAPK是MAPKs信號轉導通路的重要成員，誘導磷酸化HSP27表達的上游信號通路來促進其細胞保護作用［11］，又腦缺血后IGF－1表達增加，可激活MAPKs信號轉導通路，因而HSP27磷酸化后被激活，由胞質迅速移入細胞核而發揮作用。IGF－1能防止腦缺血再灌注中細胞內鈣超載，減輕了對HSP27表達的抑制。

在腦缺血再灌注損傷中HSP27和IGF－1對腦組織起重要的保護作用，是否可以利用 HSP27和IGF－1上述作用以及IGF－1促進血管和神經再生的作用，研制并開發藥物，將有巨大的臨床價值。

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