利用菌體生長限制效應的HBV DNA疫苗發酵工藝※

張明森 丘力功 韋 劍 王燦頂 黃 明

利用菌體生長限制效應的HBV DNA疫苗發酵工藝※

張明森 丘力功 韋 劍 王燦頂 黃 明

目的對HBV DNA疫苗工程菌的發酵工藝進行優化。方法首先通過搖瓶培養確定基礎培養基組成，提高單位菌量的質粒表達量。其次，在40 l發酵階段，通過溶氧反饋調節的補料方式產生生長限制效應，進一步獲得高拷貝表達質粒的菌體。結果培養基優化后的工程菌DH5α/pS2S發酵最終可獲得質粒304.99mg/l，質粒含量可達到2.40mg/g濕菌，超螺旋質粒DNA的比例達95%以上。結論已建立了在單位體積和單位菌量內高表達質粒HBV DNA疫苗工程菌的發酵工藝，為HBV DNA疫苗的工業規?；a奠定了基礎。

治療性HBV DNA疫苗；工程菌；發酵；生長限制

治療性HBV DNA疫苗項目為正在進行臨床研究的國家I類新藥項目。HBV DNA疫苗含有preS2＋S基因的真核表達載體質粒，不僅能誘導體液免疫反應，還能誘導細胞免疫反應，從而打破機體因HBV長期感染所引起的免疫耐受，改善機體內環境，恢復或重建機體的特異性免疫功能，在治療慢性乙型肝炎方面具有廣闊的臨床應用前景[1]。原有的發酵工藝[2]雖能產出足夠量的質粒用于下游的質粒提取純化，但由于單位菌量內質量含量不高，增加了下游的純化負擔和成本，有必要為此進行改進以適應臨床Ⅲ期和上市后的用量需求。本文利用產生饑餓效應的策略對發酵培養工藝進行了優化，在質粒產量和單位菌量質粒含量等方面取得顯著所改進?，F將結果報告如下。

1 材料

工程菌DH5 α/pS2S，拜迪公司保存；酵母粉（Yeast Extract）、胰蛋白胨（Tryptone）購自OXOID公司；質粒小量抽提試劑盒，購自QIAGEN公司；紫外可見分光光度計，日本日立公司UV-300型。甘油（Glycerol）、氯化鈉（NaCl）、葡萄糖（Glucose）、檸檬酸（Citric acid）、硫酸銨[（NH4）2SO4]、硫酸鎂（MgSO4）、磷酸鹽（Na2HPO4、KH2PO4）等均為國產分析純。

2 方法

2.1 培養基的篩選按表1配制培養基，分裝至50ml三角錐瓶中（20ml/瓶），滅菌后添加氨芐西林至100μg/ml。其中，配方I、Ⅱ、Ⅲ來源于已有工藝[2]。其后，于LB培養基中加入瓊脂（15g/l），鋪平皿，接種工程菌，于37℃培養過夜。挑單個菌落，接種于5ml LB（含AMP100μg/ml）中，37℃振蕩培養至A600為0.6時，分別取菌液200μl接種到各培養基中按預設的培養參數進行培養。培養結束后分析收菌量（濕菌重）、質粒含量（mg/l），并計算單位濕菌中質粒含量。

2.2 發酵方法

2.2.1 基礎培養基為篩選到的優化培養基發酵采用Fed-batch模式，發酵罐50l（德國B.Braun公司產品），發酵培養基按具體實施例配方表1配制，配40l，發酵罐原位滅菌后備用。補料培養基配方為：酵母提取物100g/l，甘油400ml/l。共配10l，滅菌備用。

2.2.2 工藝過程

2.2.2.1 搖瓶培養用凍存菌種接種于搖瓶培養基中，37℃劇烈振蕩16hr至對數生長期（A600為0.8）。取400ml菌液接種到發酵罐的發酵培養基中，開始進行批式補料（Fed-batch）模式的發酵培養。

2.2.2.2 Batch階段接種后首先為Batch階段。在批式階段（Batch phase），溫度控制在35℃；通過補加10%濃氨水溶液控制PH值在7.0；DO2控制在30%左右，開始階段攪拌速度設為200r/min，通氣量為70 l/min。當DO2水平低于閾值28%時，攪拌速度增加10r/min以促使DO2控制在30%，在批式階段攪拌速度最高值設為350r/min。在批式階段后期由于氧供應不足DO2將會下降，最低至2%左右。批式階段末期營養組分將消耗盡，此時工程菌代謝將趨于停止，DO2值將在短期內躍升，當DO2達到15%時。發酵開始進入補料階段（Feeding phase）。

2.2.2.3 補料階段發酵溫度升至37℃；DO2值依然控制在30%左右，當DO2值低于30%時攪拌速度以10r/min的增幅增加，直至達到最高轉速（700r/min）；在補料階段，當DO2值高于50%、PH值高于7.2時表明生長限制性的碳源缺失，此時按預設的補料速度進行補料（補料值為4ml/min），直到DO2值低于50%或PH值低于7.2時停止補料；在補料階段，通氣量保存不變，當攪拌速度達到最高轉數時，DO2因供氧矛盾而趨于下降，當DO2趨于0值時停止發酵。

2.3 分析方法質粒含量和純度的測定：采用核酸測定含量，并進行1%瓊脂糖凝膠電泳，上樣量為1μg。經凝膠成像系統掃描，分析超螺旋（SC）質粒的比例[3]。

3 結果

3.1 培養基的篩選培養基搖瓶篩選實驗表明，配方IV配制的培養基培養表達的質粒DNA單位含量明顯高于其它配方的結果（見表2）。確定配方IV為發酵基礎培養基。

3.2 發酵結果按2.2的方法進行連續三批（Lot 1001、Lot 1002與Lot 1003）的發酵。發酵收獲液的檢測結果表明，與原有工藝的發酵批次相比，改進工藝的發酵批在單位發酵體積質粒含量方面提高了1倍，在單位菌量的質粒含量提高了70%以上（見表3）。

表1 待篩選的培養基配方

表2 DH5α/pS2S工程菌在不同配方培養基的搖瓶發酵結果

表3 不同發酵工藝條件下DH5α/pS2S工程菌發酵結果比較(±s)

表3 不同發酵工藝條件下DH5α/pS2S工程菌發酵結果比較(±s)

注：*與原有工藝相比，差異十分顯著（P＜0.01）

工藝來源 發酵批次 發酵結束時A600單位體積收菌量(g/l)單位體積質粒含量(mg/l)單位菌量質粒含量(mg/g,bacteria)原有工藝 3 45.20±5.30 60.50±2.36 82.67±13.24 1.37±0.24改進工藝 3 60.00±6.20 127.08±3.08*304.99±31.06*2.40±0.31*

而根據Lot 1001批的在線檢測結果繪制的圖譜可以看出：單位發酵體積的質粒含量隨著發酵時間而逐漸增加，在發酵結束時達到最大值；單位菌量的質粒含量在批式培養階段總體亦呈增加趨勢，但在后期由于營養物耗竭而有所下降。而在進入溶氧反饋調節為特征的限制性補料階段后（約在發酵第12小時開始），單位菌量的質粒含量在短時間內有了顯著增長。此后增長趨勢一直維持至發酵結束（見圖1）。

圖1 DH5α/pS2S工程菌發酵過程中菌體生長的質粒表達量圖譜

瓊脂糖凝膠電泳表明，三批發酵批收獲液中質粒超螺旋比例檢測結果均在95%以上，達到了HBV DNA發酵相關質量標準（見圖2）。

圖2 三批改進工藝生產的DH5α/pS2S工程菌發酵純化質粒瓊脂糖凝脈電泳圖譜

4 討論

攜帶有外源基因的質粒DNA為基因治療和DNA疫苗研究開發中使用的主要藥物載體。目前，治療性的質粒DNA臨床用量已達到了mg級，因此大量制備的質粒DNA需要工業規模的大腸桿菌工程菌發酵技術來制備。在發酵策略方面，為了提高細菌發酵密度，與重組蛋白工程菌發酵工藝相似，現有的質粒DNA發酵工藝普遍采用補料-分批發酵（Fed-batch）的方法進行，即在發酵過程中基礎培養基碳源、氮源等營養成分衰竭時，通過恒速或指數型流加補料的方式提高菌體生長密度和目標產物的表達總量[5-7]。

到目前為止，現有文獻公開的質粒DNA工程菌發酵工藝目標主要以提高質?？偖a量為目標。而良好的質粒DNA發酵工藝除了能生產較高的質粒DNA總量外，還能提高單位菌量內的質粒DNA含量以適應下游純化工藝的需求。

在本研究中發現，在非工程菌最佳生長的限制性條件下（如限制供應碳源、氮源或溶氧量、較低的生長溫度等），菌體趨向于將營養底物轉化成質粒，從而提高單位菌量的質?？截悢?，此即為菌體的生長限制效應。本文中的發酵工藝改進思路為：首先通過配方篩選得出能提高單位菌量質粒含量的基礎培養基。在此基礎上，在分批發酵階段采用較低的生長溫度以進一步提高菌體的質?？截悢邓健Ｔ陔S后的補料階段，則采用溶氧反饋調節的限制性補料方式以獲得高拷貝質粒的菌體。在線檢測和最終發酵收獲液檢測結果證明了改進后的發酵工藝不僅增高了質粒總產量，還顯著提高了單位菌量的質粒含量。以上改進為治療性雙質粒HBV DNA疫苗的規?；a奠定了堅實的基礎。

[1]Yang S., Lee C., Park S., et al.Correlation of antiviral T cell response with suppression of viral rebound in chronic hepatitis B carries：a proof-of-concept study[J].Gene Therapy, 2007,13(14)：1110-1117.

[2]饒桂榮,黃英,王鵬.治療性雙質粒HBV DNA疫苗工程菌的中試發酵工藝研究[J].中國生物制品學雜志,2007,20(2)：110-113.

[3]Sambrook J., Fritsch E., Maniais T.Molecular cloning：a laboratory manual.2nd edition[M].New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989：880-885.

[4]Michael K., Gareth M.Growth Medium Selection and Its Economic Impact on Plasmid DNA Production [J].Journal of Bioscience And Bioengineering,2007,104(6)：490-497.

[5]Kevin O.,Ruth F., Frank H., et al.Strategies for high titre plasmid DNA production in Escherichia coli DH5α[J].Process Biochemistry, 2007,42：1039-1049.

[6]Heather A., Chen N.Enhanced High Copy Number Plasmid Maintenance and Heterologous Protein Production in an Escherichia coli Bio film [J].Biotechnology and Bioengineering, 2007,97(3)：439-446.

[7]Filomena S.Plasmid fermentation strategies：influence on plasmid stability and cell physiology[J].Appl Microbiol Biotechnol, 2012,93：2571-2580.

Optimization of HBV DNA Plasmid Fermentation Process by the Strategy of Bacterial Growth Limitation

Zhang Mingsen Qiu Ligong Wei Jian Wang Canding Huang Ming

ObjectiveTo optimization of HBV DNA plasmid fermentation process.MethodsThe composition of batch medium was determined to increase plasmid copy number per bacteria by shaking flask test.In the fed-batch phase of 40l fermentation,the plasmid copy number was further increased by growth limitation strategy which is characterized by DO2feedback feeding control.ResultsBy using the optimized fermentation process,plasmid content from the fermentation harvest reached 304.99mg/l or 2.40mg/g bacteria,and the proportion of supercoiled plasmid DNA was higher than 95%.ConclusionThe fermentation process was developed,with high copy number of plasmid both per liter and per bacteria.It laid a foundation of industrial scale production of the therapeutic HBV DNA vaccine.

Therapeutic HBV DNA vaccine; Recombinant engineered bacteria; Fermentation; Growth limitation

R392

A

1673-5846(2013)08-0027-03

廣州白云山拜迪生物醫藥有限公司，廣東廣州 511495

廣東省2012年重大科技專項（重要新藥創制）計劃項目（2012A080204009）

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