人類性別決定基因（SRY）的檢測及其臨床應用

陳勇周華蓉林曉容

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人類性別決定基因（SRY）的檢測及其臨床應用

陳勇1★周華蓉2林曉容3

目的探討SRY基因與兩性性別發育的關系。方法提取40例健康人外周血總DNA，加入SRY基因的特異性擴增引物和內參引物，運用聚合酶鏈式反應（PCR）技術進行 SRY基因擴增，后經瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。結果40例的基因組DNA經 PCR擴增后在500 bp和600 bp之間出現β-actin條帶，與預期的大小為517 bp的β-actin片段相吻合，說明本實驗的實驗條件的可靠性和準確性。其中20例男性在600 bp至700 bp之間出現條帶，與預期的SRY的677 bp 片段大致相符，而20例女性則無677 bp 片段產生。用該方法檢測一例外生殖器異常，染色體為46，XY社會性別為女性的患者，其SRY檢測結果為陽性。結論SRY基因陽性是雄性決定基因，用PCR技術擴增SRY 基因能快速準確檢出Y染色體。SRY基因的檢測對性連鎖遺傳性疾病和單基因突變病的無創性產前診斷有重要意義。

SRY基因 ； PCR

20世紀80年代英國科學家分離并獲得高度保守的單拷貝基因，同時發現在染色體上只要有該基因就能發育為雄性。1990年SRY（Sex determing region on Y chromosome）基因的發現是人類性別決定領域的重大突破[1]。SRY指Y染色體上具體決定生物雄性性別的基因片段。人的SRY基因位于Yp11.3，只含有一個外顯子，沒有內含子，轉錄單位長約1.1 kb，編碼一個204氨基酸的蛋白質[2]。自Sinclairt J從Y短臂上的1A1區域分離出SRY基因以來，已有大量證據表明SRY 在性別決定及分化過程中起著非常重要的作用，是人類睪丸決定因子（testis determing factor，TDF）的最佳候選基因[3]。2003年6月19日,佩基實驗室和華盛頓大學基因測序中心的合作者們，發表了Y染色體DNA序列及其分析，其中很多有趣和重要的發現。Y染色體測序結果也許是迄今人類基因組測序中結果最有趣的。我們知道一些遺傳病與性別有一定關系的[4]，例如Y連鎖遺傳病中的外耳道多毛癥，這種病只發生在男性身上，如能及時檢測出SRY基因則能很好地避免悲劇的發生，減少家庭及社會的負擔，因此探索SRY基因對醫學，遺傳學，優生學，動物育種學，法醫學等領域的研究和應用具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 對象

2009年9月期間的健康體檢標本40例，其中正常男性和女性各為20例，正常女性樣本可以作為該SRY基因擴增的陰性對照。

1.1.2 提取外周血DNA試劑

采用的是北京天根全血基因組DNA提取試劑盒。

1.1.3 PCR 試劑

PCR擴增試劑均為Promega公司產品，包括耐熱DNA聚合酶（5 U/μL），MgCl2（25 mmol/L）和10×Reaction Buffer。

1.2 方法

1.2.1 人外周血DNA的提取

嚴格按照北京天根全血基因組DNA提取試劑盒說明書進行。

王登佩把那包豬頭肉放在餐桌上擺好，穎春給我們炒了兩菜便出去守雜貨店了，我從消毒柜里拿出酒杯筷子，兩人便喝了起來。

1.2.2 目的片段的擴增

1.2.2.1 設計引物

參照參考文獻[5]并運用Primer5.0軟件進行設計，引物序列見表1：

1.2.2.2 PCR 反應體系

通過參照參考文獻[6]，最終確定反應體系如表2：

1.2.2.3 循環參數

94℃預變性5 min，94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，34個循環，72℃延伸10 min，然后4℃保存。

1.2.3 電泳檢測

取PCR產物8 μL，在含有0.5 μg/mL溴化乙錠的2%瓊脂糖凝膠中進行電泳分析。電泳條件：電壓100 V，時間50 min。凝膠成像分析系統觀察電泳結果。

1.2.4 測序驗證

將PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠回收純化后送上海生工生物工程技術服務有限公司測序，將測序產物經BLAST比對，完全符合SRY基因序列。

2 結果

2.1 SRY基因擴增結果

40例的基因組DNA經 PCR擴增后在500 bp和600 bp之間出現β-actin條帶，與預期的517 bp的β-actin片段相吻合，說明本實驗的實驗條件的可靠性和準確性。其中20例男性在600 bp至700 bp之間出現條帶，與預期的SRY 677 bp 的片段大致相符，而20例女性則無677 bp 片段產生，由此可得出結論SRY是男性決定基因。圖1為40例正常男女的PCR結果。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

圖1 40例正常男女的PCR結果Figure 1 The PCR result of 40 cases of normal male and female

PCR結果：1～8號、17～24號、33～36號泳道為正常女性，9～16號、25～32號、37～40號泳道為正常男性，M泳道為杭州博日公司的DL-100 Marker。

2.2 SRY基因的部分測序圖

將PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳后，切割下含SRY部分瓊脂糖經DNA純化后進行測序分析，圖2顯示的是部分測序的圖譜，經NIBI BLAST比對后完全符合SRY基因序列。

圖2 SRY基因的部分測序圖Figure 2 Sequencing diagram of SRY gene

2.3 SRY基因檢測的臨床應用

一例15歲社會性別為女性的患者，以月經未來潮來我院婦產科就診，后經B超診斷為先天性無子宮，后經染色體檢查，其核型為46，XY。結論為染色體性別與社會性別不符。其核型圖及SRY電泳圖如圖3，圖4所示。

圖3 患者的核型圖Figure 3 Karyogram of patient

圖 4 患者的PCR結果Figure 4 PCR result of patient

3 討論

以往的研究表明[7]，SRY基因在睪丸發育早期，發揮短時間的啟動作用，可調節某些基因，但又受制于另一些基因，這些基因相互作用，決定著性別的分化發育。人類性別的形成包括性別決定和性別分化2個過程, 性別決定屬于XY型，即由性染色體XX決定女性、XY決定男性。胎兒時，人類性別發育就由Y染色體上的性別決定基因而決定，此基因突變、易位或缺失可導致發育異常[8]。Y染色體上95%是男性特異區域,里面含有和男性有關的基因，不和其它染色體進行DNA重組來交換遺傳物質，不重組導致遺傳物質缺乏活力，不斷積累壞的突變、又不能有效獲得好的變化，這是Y染色體不斷走向滅亡的主要原因之一。而性別分化除與性染色體有關外，還與諸多基因有關。一個正常男性的形成至少需要Y染色體上的睪丸決定因子（TDF）和H-Y抗原基因、X染色體上的AR基因、常染色體上的5-α還原酶基因等基因的協同作用。1990年，Sinclair等克隆到了Y染色體上的性別決定區域SRY。大量實驗證明SRY是TDF的最佳候選基因，是人類性別形成的主要基因，但不是決定人類性別的唯一基因。人類性別的形成實際上是以SRY基因為主導的、多基因參與的、有序協調表達的生理過程[9]。

本實驗基于對基因組DNA具有高度選擇性的高分子膜材料，只需少數幾個步驟即可完成提取過程，在短時間內完成高純度DNA的提取，無需昂貴的設備，完全避免采用有毒或是具有危險性的試劑，如苯酚，氯仿等。在實驗方法方面，為了最大限度地降低PCR的假陽性擴增，我們采用了樣品制備和擴增隔離的方法以及抽換室內空氣和全部使用一次性吸頭、離心管。從而使污染控制到最低程度，保證了結果的準確性。

使用自行設計的引物進行SRY特異性基因的擴增，成功的應用于核型為46，XY患者的基因診斷，確認該患者是男性，從而為該患者的變性手術提供了可靠的診斷依據[10]。

實驗結果顯示SRY陽性是男性決定基因，PCR技術提高了檢測SRY基因的特異性和靈敏度，縮短了操作時間，快速，準確，特異性強。

[1] 焉波, 張思仲. 人類SRY基因的研究進展[J]. 中華醫學遺傳學雜志, 1995, 12(5): 282-286.

[2] Alvarez-Nava F, Martínez M C, González S, et a1. Fish and PCR analysis of the presence of Y-chromosme sequences in a patient with Xq-isochromosome and testicular tissues[J]. Clin Genet, 1999, 55(5): 356-610.

[3] Ottolenghi C, McElreavey K. Deletions of 9p and the quest for a conserved mechanism of sex determination[J]. Mol Genet Metab, 2000, 71(1-2): 397-404.

[4] 陳紅, 杜曉娟, 孫國賢, 等. 中國人SRY基因的分離、克隆及核苷酸序列分析[J]. 生物化學雜志, 1993, 9(2): 219-223.

[5] Bardoni B, Zanaria E, Guioli S, et al. A dosage sensitive locus at chromosome Xp21 is involved in male to female sex reversal[J]. Nat genet, 1994, 7(4): 497-501.

[6] 易萍, 李力, 顏耀華, 等. 應用母親血漿常規PCR技術進行胎兒性別鑒定[J]. 中國婦幼保健, 2006, 21(6): 836-837.

[7] Koopman P, Gubbay J, Vivian N, et al. Male development of chromosomally female mice transgenic for Sry[J]. Nature, 1991, 351(6322): 117-121.

[8] 王崇新, 馬咸成, 葉大勛, 等. 多聚酶鏈式反應檢測睪丸女性化綜合征患者的Y染色體[J]. 中國優生與遺傳雜志, 1996, 4(5): 26-27.

[9] Wu J B, Chen K, Li Y, et al. Regulation of monoamine oxidase A by the SRY gene on the Y chromosome[J]. FASEB J, 2009, 23(11): 4029-4038.

[10] Akbas E, Soylemez F, Hallioglu O, et al. Analysis of the SRY gene in a girl with 45, X/46, XY genotype[J]. Genet Couns, 2009, 20(3): 249-254.

The detection and clinical application of human sex determination gene on Y chromosome by PCR

CHEN Yong1★, ZHOU Huarong2, LIN Xiaorong3
(1.Department of Medical Laboratory, First Affiliated Hospital of Fujian Medical University, Fujian, Fuzhou 350005, China; 2.Department of Hematology, Af fi liated Union Hospital of Fujian Medical University, Fujian, Fuzhou 350001, China; 3.Department of Medical Laboratory, Second Affiliated Hospital of Fujian Medical University, Fujian, Quanzhou 362000, China)

Objective To investigate the relationship between sex determination gene on Y chromosome (SRY) gene and sexual development. Methods Peripheral blood total DNA were extracted in 40 cases of healthy persons, which adding SRY gene-speci fi c ampli fi cation primers and internal control primers. Then the SRY gene were ampli fi cated by polymerase chain reaction (PCR) technology and detected by agarose gel electrophoresis. Results 40 cases of genomic DNA appeared β-actin bands between 500 bp and 600 bp after PCR ampli fi cation, which coincided with the expected size of 517 bp of β-actin fragment, showed that the experimental conditions were reliable and accurate. 20 cases of male appeared bands between 600 bp and 700 bp, which coincided with the expected size of 677 bp fragment, while 20 cases of female without 677 bp fragment. A case of genital abnormalities patient was detected by this method, which chromosome as 46, XY, gender female, and the SRY test result was positive. Conclusion SRY gene was male-determining gene, which ampli fi ed by PCR, could be rapidly and accurately detected on the Y chromosome. It is important to detect the SRY gene for the non-invasive prenatal diagnosis of sex-linked genetic diseases and single gene mutation disease.

Sex determining region on Y chromosome； PCR

1.福建醫科大學附屬第一醫院檢驗科，福建，福州350005 2.福建醫科大學附屬協和醫院，福建，福州 350001 3.福建醫科大學附屬第二醫院檢驗科，福建，泉州 362000

★通訊作者：陳勇，E-mail:chenyon_bear@yahoo.com.cn