中國北方漢族新生兒人群ACE和AGT基因遺傳多態性的研究

崔麗娟 杜宏偉 周毓玲 劉志霈韓俊領

中國北方漢族新生兒人群ACE和AGT基因遺傳多態性的研究

崔麗娟1杜宏偉2周毓玲2劉志霈1韓俊領2

目的研究血管緊張素轉換酶（ACE）插入/缺失（I/D）和血管緊張素原（AGT）基因第2外顯子M235T多態性各等位基因及基因型在中國北方漢族新生兒人群中的分布頻率，比較其在不同種族間的分布差異。方法分別應用聚合酶鏈式反應和基因測序方法研究了1538名健康新生兒ACE基因多態性分布情況和804名健康新生兒M235T等位基因的變異。結果①ACE I/D基因型和等位基因頻率與桂西壯族、新疆維吾爾族、內蒙古鄂倫春族、印度人和美國人比較存在顯著差異（P<0.01），與巴基斯坦和臺灣人比較無統計學差異；AGT基因型和等位基因頻率與桂西壯族、苗族、埃及人及葡萄牙人基因型和等位基因頻率比較存在顯著差異（P<0.01），與云南彝族存在不顯著差異，與非裔巴西人比較無統計學差異。②ACE及AGT位點基因型及等位基因分布頻率在中國北方漢族新生兒人群中沒有性別差異。結論 中國北方漢族新生兒人群ACE I/D及AGT M235T多態性分布與不同種族人群中存在差異，但無性別差異。

血管緊張素轉換酶；血管緊張素原；基因多態性；種族

血管緊張素轉換酶（angiotensin converting enzyme，ACE）基因位于17q23，其插入/缺失（I/D）多態性是位于ACE基因第16個內含子的一段287 bp Alu序列多態性，ACE基因I/D多態性和血清ACE活性之間存在相關性，其中DD型ACE活性最高，ID型居中，II型最低。血管緊張素原（angiotensinogen，AGT）是腎素-血管緊張素系統（renin-angiotensin system，RAS）的唯一底物，RAS系統與血壓調節密切相關。肝臟合成并分泌的AGT在腎素作用下轉變為血管緊張素Ⅰ，后者在ACE作用下轉變為血管緊張素Ⅱ。血管緊張素Ⅱ是很強的縮血管物質，可刺激醛固酮分泌，引起水鈉潴留，導致血壓升高。人AGT基因位于染色體1q42~43位點，其第2外顯子（+704）位T→C突變，導致編碼產物第235位氨基酸Met→Thr的改變，即M235T突變（rs 699）。血漿中AGT水平的高低直接影響著RAS系統活性的強弱。大量研究發現M235T變異與原發性高血壓的發生有關。為了解這兩個位點多態性在中國北方漢族新生兒人群中的分布特征，我們共檢測了1538份血樣，并將結果與其他文獻中不同種族人群的分布頻率進行了比較，探討其多態性是否存在種族、性別差異，為進一步開展與疾病的相關性研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

隨機選取2009年6月至2010年12月間在天津濱海協和基因科技有限公司進行基因檢測的1538名無血緣關系的漢族新生兒受檢者標本，來自東北、華北、西北三個地域。其中男性879例，女性659例，均無遺傳病家族史。檢測1538份ACE I/D多態性，804份AGT M235T位點多態性。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取

取ACD 抗凝臍血，用TIANGEN血液基因組DNA提取系統提取DNA，其濃度在20~250 ng/μL，OD260/280比值1.7~2.0，-20℃保存。

1.2.2 基因分型

PCR試劑及Tag DNA聚合酶購于大連寶生物公司。引物合成于上海Invitrogen公司。

ACE基因I/ D多態性檢測：PCR引物序列F：5'-CCCATCCTTTCTCCCATTTC-3'，R：5' -CATGCCCATAACAGGTCTTC-3'。擴增條件為預變性94℃ 1 min，94℃ 30 s，55℃ 35 s，72℃ 1 min，共32個循環。擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳后，通過紫外成像系統照相觀察電泳區帶位置。電泳片段送于上海Invitrogen公司測序，驗證結果準確性。采用測序法對AGT M235T位點進行分型檢測，由深圳華大基因公司完成，所用引物序列為F：5'-CCTGAAGCAGCCGTTTGT-3'，R：5' -TGGAAGTGGACGTAGGTGTT-3'。擴增條件為預變性94℃ 1 min，94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，共32個循環。

1.2.3 統計學分析

根據基因型頻率計算等位基因頻率；采用χ2檢驗分析測得的基因型頻率與Hardy-Weinberg 平衡的符合程度；比較本組結果與其他文獻公布的不同種族人群之間的差異；分析本組結果的基因型頻率及等位基因頻率是否存在性別差異。

2 結果

2.1 基因型檢測結果

ACE基因I/ D多態性，觀察到3種基因型：II型（插入純合子，498 bp），DD型（缺失純合子，209 bp），ID型（缺失與插入雜合，含498 bp和209 bp兩個片段），見圖l。將電泳片段及下游引物送于上海Invitrogen公司測序，經驗證，電泳方法判讀基因型準確可靠，反向測序結果見圖2，箭頭所指為Alu序列插入位點。

AGT基因測序結果與GeneBank對照，堿基序列一致。箭頭所指為M235T位點，堿基為T或C，結果見圖3。

2.2 群體代表性檢驗

圖1 ACE 基因I/D多態性凝膠電泳結果Figure 1 The results of ACE I/D polymorphism by PCR

圖2 ACE基因I/D測序結果Figure 2 The results of ACE I/D by sequencing

圖3 AGT基因M235T位點測序結果Figure 3 The results of AGT M235T by sequencing

DNA標本的ACE I/D及AGT M235T基因型頻率經χ2檢驗，P>0.05，均符合Hardy-weinberg平衡，表明研究對象來自同一群體，具有較好的代表性。

2.3 ACE I/D及AGT M235T多態性分布在不同種族人群間的比較（見表1、2）

結果顯示，1538份血樣的ACE I/D多態性基因型分布頻率為II 40.8%、ID44.8%、DD 14.4%，等位基因頻率I 63.2%、D 36.8%；804份血樣的AGT M235T基因型頻率為MM 3.6%、 MT 36.9%、TT 59.5%，等位基因頻率M 22.1%、T 77.9%。ACE I/D多態性分布頻率與巴基斯坦和臺灣人比較，P>0.05，無統計學差異；與桂西壯族、新疆維吾爾族、內蒙古鄂倫春族、印度人和美國人比較，P<0.01，存在顯著差異。AGT M235T多態性分布頻率與文獻報道的其他種族數據進行了統計學分析，經χ2檢驗，本研究數據與桂西壯族、苗族、埃及人及葡萄牙人基因型和等位基因頻率比較，P<0.01，存在顯著差異；與云南彝族存在不顯著差異；與非裔巴西人比較，P>0.05，不存在統計學差異。

2.4 ACE I/D及AGT M235T基因型和基因頻率性別分布特點（見表3）

ACE I/D及AGT M235T基因型和基因頻率在男性與女性中的分布經χ2檢驗，P>0.05，兩個基因位點的基因型和等位基因分布頻率沒有性別差異。

2.5 ACE I/D及AGT M235T基因型協同分布頻率（見表4）

進行AGT M235T檢測的804份血樣也同時進行了ACE I/D多態性檢測，結果顯示，以ID/TT型和II/TT型為主，ID/MT型和II/MT型次之，DD/MM型最少。

表1 不同種族人群ACE基因 I/D多態性分布頻的比較率Table 1 The distribution frequencies of ACE I/D polymorphism in different races

表2 不同種族人群AGT基因 M235T位點多態性分布頻率的比較Table 2 The distribution frequency of AGT M235T polymorphism in different races

表3 男性、女性ACE I/D及AGT M235T位點多態性分布頻率分布的比較Table 3 The distribution frequency of ACE I/D and AGT M235T polymorphisms in male and female

表4 ACE I/D及AGT M235T位點基因型協同分布頻率Table 4 Synergetic distribution frequencies of ACE I/D and AGT M235T genotype

3 討論

腎素-血管緊張素系統主要維持體內電解質穩定和調節血壓，ACE是RAS的關鍵酶。ACE具有兩個功能，一是將血管緊張素I 轉變成具有強烈縮血管活性的血管緊張素II，二是滅活具有擴血管作用的緩激肽。AGT是活性物質血管緊張素II的唯一前體，血漿中AGT蛋白濃度直接影響血管緊張素II的生成，進而影響血管抗性和血壓。國內外學者針對ACE I/D和AGT M235T多態性分布及其與多種疾病的關系進行了深入研究。Ana等[11]對葡萄牙人群的研究證實，ACE DD 和ACE 1860GG 是葡萄牙人群冠狀動脈疾病的危險因素，且基因多態性與經典致病因素如高血壓、肥胖、糖尿病和血脂障礙在冠狀動脈疾病的發生發展中具有協同效應，AGT 235TT合并高血壓或血脂障礙是該疾病的易感因素之一。一項關于埃及人群中2型糖尿病的基因相關性分析顯示，攜帶ACE DD/AGT TT基因型的個體發生2型糖尿病的危險性是攜帶一個危險基因型如ACE DD或AGT TT個體的14.5倍（95%CI 1.783~118.083，P=0.012）[10]。Chen[6]針對臺灣地區111名急性冠脈綜合征（ACS）患者與195例對照人群檢測ACE I/D多態性，結果發現，ACE DD 基因型是ACS尤其是急性心肌感染的獨立危險因素，而且認為，DD基因型與ACS的嚴重程度以及心源性猝死的高危險性相關聯，并建議對有ACS病史的患者進行ACE分型檢測，對DD型患者強化預防護理。

國內學者祝有國[9]等研究中國苗族人群AGT M235T和ACE I/D 多態性與原發性高血壓（EH）的關系，發現T235等位基因頻率在EH組中明顯高于對照組，TT基因型的發病風險明顯高于MM型，且隨著T等位基因的增加，發生原發性高血壓的風險也增加，進一步分析T?D等位基因造成的EH相對危險性（OR）值也表明，T?D等位基因可能作為EH相對的各自獨立危險因素。在北方漢族原發腎病綜合征兒童ACE I/D和AGT M235T多態性研究中，攜帶ACE D等位基因、AGT MT基因型、同時攜帶D、T等位基因的兒童為原發腎病綜合征的易感人群，攜帶ACE DD基因型的原發性腎病綜合征患兒易復發，且可能合并高膽固醇及高三酰甘油血癥，預示可能有激素耐藥傾向[13]。

本研究中中國北方漢族新生兒人群ACE和AGT基因多態性分布無性別差異，與其他文獻公布的數據比較存在明顯的種族差異。北方漢族新生兒ACE與AGT協同分布頻率以ID/TT型（26.4）和II/TT型（25.0）為主，ID/MT型和II/MT型次之。這與Soheir[10]對埃及人群進行檢測得到的ID/MT型（26.3）和ID/MM型（21.3）為主，DD/MT型和II/MT型次之不同，提示存在種族間差異。當然樣本數量上的差異可能對結果產生一定影響。但是檢測ACE與AGT聯合基因型分布頻率對于研究高血壓、2型糖尿病等多基因遺傳病的作用要比單基因分布頻率更為重要。鑒于ACE D與AGT T等位基因對心腦血管疾病、糖尿病、腎病等多種疾病的致病風險，提示對新生兒進行基因多態性檢查具有早發現、早預防的積極意義。而且本研究中新生兒人群ACE和AGT分布特征的大樣本數據，可以為相關的臨床疾病研究提供準確的對照參數。

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勘誤聲明

由于我們校對上的疏忽，本雜志在排版印刷上出現了一些錯誤，現糾正如下：

2013年第1期文章“一罕見成骨不全IV型的基因診斷”（第12頁）摘要中的“c.823G>C1/p.G275R”改為“c.823G>C/p.G275R”。

為我們工作上的疏忽給廣大讀者閱讀與引用上帶來的不便表示抱歉，也為這一錯誤給作者帶來的麻煩表示深深的歉意。同時對指出我們錯誤的讀者表示衷心的感謝，我們誠心希望廣大讀者能夠繼續厚愛我們的雜志，隨時對我們的工作提出批評和指導。《分子診斷與治療雜志》編輯部

2013年1月29日

Study on ACE and AGT gene polymorphisms in northern Han newborns of China

CUI Lijuan1, DU Hongwei2, ZHOU Yuling2, LIU Zhipei1, HAN Junling2
(1.Tianjin Binhai Union Gene Technology Co.Ltd, Tianjin 300384, China; 2.Union Stemcell&Gene Engineering Co.Ltd, Tianjin 300384, China)

Objective To investigate angiotensin converting enzyme(ACE) insertion/deletion(I/D) and angiotensinogen(AGT) the second exon M235T polymorphisms and distribution features between Chinese northern Han newborns and the others ethnic populations. Methods 1538 blood samples were genotyped by PCR for ACE gene. M235T polymorphism of AGT gene were analyzed by sequencing in 804 healthy newborns.Results ①Signif i cant differences in ACE I/D genotype and allele frequencies were observed between this study and those in Zhuang population, Xinjiang Uygurs, Olunchun, Indians and Americans(P<0.01). But there were no differences from Pakistani and Taiwanese. AGT genetype and allele frequencies of Chinese northern Han population were signif i cant differences from those of Zhuang population, Miao popultion, Egyptian and Portuguese population(P<0.01), and there were no signif i cant diffrence from those of Yi Nationality population of Yunnan and African-derived Semi-Isolated Braziliams. ②No Signif i cant differences of ACE and AGT gene in terms of gender was found in Chinese northern Han newborns. Conclusion Our results suggested that polymorphisms of ACE I/D and AGT M235T were statistically different among races, but no difference existed in terms of gender .

Angiotensin converting enzyme; Angiotensinogen; Gene polymorphism; Race

1.天津濱海協和基因科技有限公司，天津 300384 2.協和干細胞基因工程有限公司，天津 300384