改良碘化鉀法提取凍存外周血基因組DNA的方法探討

蔡雪梅 李穗雯 胡大春

改良碘化鉀法提取凍存外周血基因組DNA的方法探討

蔡雪梅 李穗雯 胡大春★

目的探討用改良碘化鉀法（改良法）提取長期凍存外周血基因組DNA的方法。方法對碘化鉀（KI）法加以改良，包括：血量由100 μL增加到200 μL；使用0.9% NH4CL溶液代替無菌重蒸餾水裂解紅細胞；增加裂解白細胞膜的5 mol/L KI溶液的用量（為70 μL）；低溫（4℃）離心。然后用改良碘化鉀法從82份-80℃凍存外周血標本中提取基因組DNA。同時使用碘化鉀法提取其中的30份血標本，比對兩種方法提取DNA的濃度和純度，并進行CYP2C19相關基因PCR擴增。結果兩種方法所提取的DNA濃度和純度分別是碘化鉀法為128.2±34.9 μg/mL和A260/A2801.74±0.08，改良法為220±91.29 μg/mL和A260/A2801.87±0.12。改良法獲得的DNA純度更高，差異有統計學意義（P<0.01），通過增加樣本量及對方法進行改良獲得的DNA量較多。對改良后方法提取的基因組DNA進行PCR擴增，結果穩定。結論改良碘化鉀法從長期凍存外周血中所提取的基因組DNA質量較高，能夠滿足對臨床凍存樣本研究的需求。

基因組DNA；碘化鉀法；改良法；外周血

隨著醫學研究的不斷深入，很多疾病的研究都集中到基因水平上，基因組DNA的提取成為首要問題。目前提取基因組DNA的方法比較多，有傳統的蛋白酶K消化法、尿素提取法、酚/氯仿提取法、碘化鈉法、碘化鉀法[1~2]以及較先進的自動化提取法[3~4]等。其中碘化鉀法抽提外周血基因組DNA具有簡單、經濟、高效的特點，但從長期凍存血樣中獲取DNA其純度相對較差，難以滿足對DNA純度要求較高的分子生物學實驗[5~6]。而實際研究過程中，大量臨床血樣收集后需要凍存，以便分批進行基因組DNA提取。如何從長期凍存外周血中提取具有較高濃度和純度的基因組DNA，是后續試驗成功的關鍵。本文對常規碘化鉀法[7]進行改良，并應用于82份-80℃長期凍存外周血樣本的DNA提取和分析，結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

儀器：SHATOS高速冷凍離心機、eppendorf紫外分光光度計、Bio-Rad thermal cycler擴增儀、Bio-Rad Power/Pac3000電泳儀、Bio-Rad凝膠成像分析系統。化學試劑：氯仿、異戊醇、異丙醇、無水乙醇等，均為分析純。

1.2 血液標本來源及保存

82例全血標本來源于昆明地區彝族志愿者（具有知情同意權），EDTA-K2抗凝，充分混勻后-80℃凍存備用。

1.3 改良碘化鉀法

基于文獻[7]的碘化鉀法進行部分改良：血量由100μL增加到200μL；使用0.9% NH4CL溶液代替無菌重蒸餾水裂解紅細胞；增加用以裂解白細胞膜的5 mol/L KI溶液用量，由20μL增加到70μL；離心均在低溫（4℃）下進行。操作步驟如下：①取EDTA-K2抗凝血200μL加入到預先加有1.0 mL 0.9% NH4CL溶液的1.5 mL Eppendorf管中，并混勻，靜置10 min至清亮后低溫4℃12000 r/min離心5 min，棄上清，再重復上述實驗步驟一次；②取沉淀加5 mol/L KI溶液70μL，旋渦振蕩充分混合30 s；再依次加入0.9% NaCl溶液300μL、氯仿-異戊醇（24:1）混合液450μL，振蕩混合1 min后，12000 r/min低溫4℃離心5 min，然后吸取水相層，轉移到另一個1.5 mL Eppendorf管中；③加異丙醇180μL，輕輕混勻，12000 r/min低溫4℃離心5 min，棄上清；④加無水乙醇1.0 mL，12000 r/min低溫4℃離心5 min，棄去無水乙醇；⑤待干后加20μL TE使其溶解，-4℃保存備用。

1.4 基因組DNA的電泳分析、濃度及純度鑒定

1.4.1 兩種方法提取基因組DNA的電泳分析

取提取的DNA樣品5μL，加6×Loading Dye上樣緩沖液2μL混勻，0.8 %瓊脂糖凝膠130 V電壓條件下電泳30 min，在紫外燈下觀察結果，用凝膠成像分析系統拍攝成像。

1.4.2 DNA濃度及純度分析

取DNA提取物5μL，加95μL超純水稀釋，超純水調零后，用紫外分光光度計測定提取的基因組DNA在波長260、280 nm的OD值，計算DNA濃度、純度。

1.4.3 CYP2C19相關基因PCR擴增

對用改良法提取的82例凍存外周血基因組DNA進行CYP2C19相關基因PCR擴增。根據文獻報道[8~9]設計引物，通過NCBI-BLAST比對后,由上海生物工程有限公司合成：正向引物，5'-CAACCAGAGCTTGGCATATTG-3'；反向引物，5'-TCACAAATACGCAAGCAGTCA-3'，PCR擴增目的片段為301 bp。PCR反應體系50μL中加DNA模板1μL。PCR循環參數[10~11]：預變性 94℃ 3 min；94℃變性 30 s，58℃退火30 s，延伸72℃ 45 s，共30個循環后72℃延伸7 min一個循環。PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢查擴增條帶是否與預計片段大小一致。

1.5 統計學處理

使用SPSS19.0軟件進行統計分析，定量數據以均數±標準差表示，DNA純度比較采用t檢驗和方差分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩種方法提取DNA的電泳分析結果

同一樣本用常規碘化鉀法[7]和改良碘化鉀法提取的DNA經瓊脂糖凝膠電泳后在Bio-Rad凝膠成像系統中進行分析，結果顯示：改良碘化鉀法點樣附近有一致密條帶，結果滿意（圖1）。

2.2 DNA的濃度及純度

用碘化鉀法[7]和改良碘化鉀法從30份凍存-80℃外周血抽取基因組DNA，其濃度和純度分別為碘化鉀法128.2±34.9μg/mL和A260/A2801.74±0.08，改良碘化鉀法為220±91.29μg/mL和A260/A2801.87±0.12，改良碘化鉀法通過增加樣本量獲得的DNA量相對多；比較兩種方法提取DNA的純度，經t檢驗，t=5.698，P<0.01，差異有統計學意義。

2.3 CYP2C19相關基因PCR擴增

以原有碘化鉀和改良碘化鉀法提取同一樣本的DNA為模板進行CYP2C19相關基因擴增，PCR產物電泳出現一條301 bp大小的DNA條帶，與預期的CYP2C19相關基因片段的大小一致。兩方法結果顯示比較，改良碘化鉀法與原有碘化鉀法均可獲得較為穩定滿意的條帶（如圖2和圖3）。

3 討論

本研究將常規碘化鉀法[7]稍加改良，其中有：破壞紅細胞采用0.9% NH4CL溶液，由于溶液呈弱酸性，能比較溫和地溶解破壞紅細胞，對白細胞起到相對保護作用；將原方法中用無菌重蒸餾水500μL使用一次，改為0.9% NH4CL溶液1.0 mL且重復二次，使紅細胞溶解得更加完全，有利于保障DNA的純度，避免血紅蛋白對PCR擴增的干擾；血量由100μL增加到200μL，使單位體積內白細胞數相對增加而提高DNA的產量；同時增加高濃度KI的用量，可使碘化鉀溶液在短時間內直接裂解白細胞膜、核膜，完全充分，使DNA釋放出來。在低溫（4℃）下離心，盡可能使DNA不被破壞以保證其完整性。通過常規沉淀、洗滌，即可完成基因組DNA的提取。

圖1 兩種方法提取DNA的電泳分析結果Figure 1 Electrophoretic analysis of the two methods of extracting DNA

圖2 原有KI法提取凍存外周血DNA的PCR結果Figure 2 PCR results of frozen blood DNA extracted by KI method

圖3 改良KI法提取凍存外周血DNA的PCR結果Figure 3 PCR results of frozen blood DNA extracted by the modif i ed KI method

通過對改良前后方法的比對，結果顯示改良后方法提取的DNA純度優于改良前方法。用改良后方法提取的DNA作為模板，進行CYP2C19相關基因PCR擴增，獲得滿意結果（圖3）。提示改良碘化鉀法能從凍存外周血中提取出質量較高DNA分子。此改良法所用試劑均為實驗室常用試劑，價格便宜，配制簡便，且方法易于掌握，重復性好，能較好滿足樣本數量大的臨床研究需求。

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A improved method for extracting genomic DNA from reserved blood

CAI Xuemei, LI Suiwei, HU Dachun★
(GanMei Hospital of Kunming Medical University, The Clinical Disease Molecular Biology Laboratory of Kunming, Yunnan, Kunming 650011, China)

Objective To explore the modif i ed potassium iodide method (Improved method) for extracting the long-term cryopreservation of peripheral blood genomic DNA. Methods The potassium iodide (KI) method was improved by increasing the blood volume from 100μL to 200μL, replacing the sterile distilled water with 0.9% NH4CL solution for destruction the red blood cells, increasing the 5 mol/L KI solution dosage(70μL) for cracking the white cells membrane, and centrifuging at low temperature(4℃). The modif i ed potassium iodide method was used for extracting the genomic DNA from 82 blood samples reserved in -80℃, and the concentration and purity of the extracted DNA was compared with the KI method. Meanwhile the extracted DNA was used as the template to amplify CYP2C19 gene by PCR. Results The extracted DNA concentration and A260/A280of the KI method and the improved method were 128.2±34.9μg/mL, 1.74±0.08 and 220±91.29μg/mL, 1.87±0.12, respectively. The DNA purity of improved method was higher, and there were signif i cant statistically different (P<0.01). The amount of DNA extracted by the modif i ed method was more than that of KI method. The genomic DNA extracted by improved method were amplif i ed using PCR, which result were stable. Conclusion The genomic DNA extracted from the long-term cryopreservation of peripheral blood using improved KI method had higher quality, which were able to meet the demand on the clinical study of cryopreserved samples.

Genomic DNA; Potassium iodide method; Improved method; Peripheral blood

昆明醫科大附屬甘美醫院，昆明市臨床疾病分子生物學重點實驗室，云南，昆明 650011

★通訊作者：胡大春，E-mail:hudach@163.net