鵝細小病毒與番鴨細小病毒差異分析及鑒別診斷方法研究進展

鮮思美

(貴州大學動物科學學院，貴州省動物疫病研究所，貴州貴陽 550025)

小鵝瘟(Gosling plague，GP)是由鵝細小病毒(Goose Parvovirus，GPV)引起雛鵝的一種高致死性疾病，又稱鵝細小病毒感染(Goose parvovirus infection，GPVI)或Derzsy’s 病。該病是以急性腸炎及肝、腎、心臟實質臟器敗血性病變為特征的烈性傳染病，傳播迅速，以4～20日齡雛鵝消化道，尤以小腸部位的纖維素性、栓塞性病變為主要特征。該病病程短促，傳染性強，傳播快，死亡率高［1］。

番鴨細小病毒病是由番鴨細小病毒(Muscovy duck Parvovrius，MDPV)引起侵襲雛番鴨為主的一種急性傳染病，臨床上以喘氣、腹瀉及胰臟壞死和出血為主要特征［2］。鵝細小病毒病和番鴨細小病毒病是嚴重危害水禽飼養業的傳染病，臨床上常在同一地區流行，甚至混合感染。兩種疫病的流行病學、臨床癥狀、病理變化都非常相似;兩種病毒的大小、形態、結構蛋白、理化特性、核酸類型和基因組結構等方面也非常相似，兩者的血清也有一定的交叉保護性，用常規的血清學檢測方法很難將這兩種病毒區分，臨床上鑒別診斷難度較大。我國是發現和研究鵝細小病毒病和番鴨細小病毒病最早的國家，于1988年在國內外首次明確了MDPV 不同于GPV，兩者存在差異［3－4］。本文從病毒的基因組結構、病毒編碼蛋白方面進行比較分析，概述兩種病毒在基因組結構和抗原性上存在的差異及已建立的鑒別診斷方法。

1 病毒的基因組結構比較

GPV與MDPV 兩者同屬于細小病毒科細小病毒屬，基因組為單股、線狀DNA，正極性DNA 鏈的病毒粒子和含有負極性DNA 鏈的病毒粒子數目基本相等［5］。匈牙利學者Zadori［6］(1995)對GPV和MDPV 毒株進行了核苷酸序列測定，并與禽和哺乳動物的細小病毒進行了比較。MDPV FM株核苷酸長為5132 bp，GPV B株核苷酸長為5106 bp，兩者在核苷酸水平上有81.9%相同。GPV 全基因結構見圖1。

圖1 GPV 基因組結構圖(5106 bp)Fig.1 Genome structure of GPV(5106 bp)

賀娟［7］(2007)將GPV和MDPV的基因序列進行了比對:(1)GPV 179～4910 bp 序列與MDPV187～4927 bp 序列方向相同，同源性為82%;(2)GPV 4919～5105 bp與MDPV187～1的同源性為85%，但方向相反;(3)GPV93～177 bp 序列與MDPV 5083～4998 bp 同源性為94%，但方向相反;(4)GPV的2～151 bp 序列與MDPV5132～4980 bp同源性為88%，方向也是相反。GPV 較MDPV 基因組序列少的26 bp 分布于:左側ITR 序列中，GPV 缺失11 bp;右側ITR中，GPV 較MDPV少10 bp;在結構蛋白(VP)終止子后，GPV 較MDPV 少5 bp。GPV 較MDPV 基因組序列少的26 bp全部分布于非編碼序列中。GPV 較MDPV 基因組中編碼蛋白質的區域，兩者之間大小相同，不存在缺失或額外的插入序列，而是表現為堿基替代。張云等［8］(2008)發現鵝和番鴨細小病毒非結構蛋白基因(NS)全長為1884 bp，編碼627個氨基酸;結構基因(VP)全長為2199 bp，編碼732個氨基酸;鵝細小病毒和番鴨細小病毒NS 之間的核苷酸和氨基酸同源性分別為80.9%～82.9%和89.5%～91.2%，而鵝細小病毒間為93.7%～99.8%和96.8%～99.7%，番鴨細小病毒間為98.8%～99.8%和98.6%～99.5%;鵝細小病毒和番鴨細小病毒VP1之間核苷酸和氨基酸同源性分別為79.7%～88.7%和85.5%～93.3%，而相應的鵝細小病毒間為88.8%～99.6%和91.5%～99.2%，番鴨細小病毒間為98.1%～99.6%和97.1%～98.8%。婁華等［9］(2001)將MDPV－Q VP2蛋白基因序列與GPV VP2蛋白基因序列進行了比較，發現其同源性只有80.5%。季芳等［10］(2004)比較了MDPV GD株和GPV GD株，基因組同源性達81.30%，VP1基因編碼的核苷酸的同源性為87%，VP2基因核苷酸同源性為84%，VP3基因核苷酸同源性為80%。兩種病毒的VP2至VP3起始密碼子之間的核苷酸存在較大差異，其同源性僅為64%。GPV和MDPV的Rep 基因的同源性達90.6%。孔憲剛等［11］(2005)將GPV HG5/82株基因與MDPV的NS 基因進行序列比較，核苷酸同源性為81%，氨基酸同源性為89%，有65個氨基酸發生變異，主要集中在NS 蛋白的羧基端。將HG5/82與國外發表的MDPV FM株的結構基因進行比較，其核苷酸及氨基酸序列同源性分別為80%和85%。其中有102個氨基酸發生變異，主要集中在VP2和VP3起始密碼子之間的146～198位氨基酸。GPV VP2起始密碼子為不典型的ACG，而MDPV VP2的起始密碼子為典型的ATG。GPV 結構基因中的4個糖基化位點有3個，與MDPV 相同，而位于結構基因700～702位的NFS 在MDPV中變為NFG。MDPV結構基因共有6個糖基化位點，位于3個結構基因的共同區。GPV與MDPV 氨基酸序列在440～530位變化較大，其中GPV 結構基因在443～445位為NFN，而MDPV 在此為糖基化位點NFS;GPV 在493～495位為NWN，而MDPV 為NWS。糖基化位點與病毒和宿主細胞的吸附有關，是病毒感染宿主的必需區，因此推測這些糖基化位點的差異可能與病毒感染宿主的特異性有關。程由銓等［12］(2001)采用限制性核酸內切酶酶切技術對MDPV和GPV退火形成的雙鏈DNA和經Klenow 酶合成的雙鏈DNA 進行分析，證明MDPV和GPV 核酸的EcoR I、Kpn I和Sac I 酶切位點不同，合成的雙鏈MDPV和GPV 核酸的Sac I、BstX I、Bg Ⅲ、Pst I和EcoR I 酶切位點不同，從而表明MDPV和GPV 核酸在結構上有明顯差異。李雪梅等［13］(2001)對國內4株GPV和2株MDPV的Rep 基因進行酶切分析比較，發現酶切位點有較大差異，即GPV 缺乏Sac I位點，但有Pst I 位點，不同毒株間EcoR I 位點有差異;而MDPV 則有Sac I和EcoR I 位點，但無Pst I位點。

2 病毒編碼蛋白比較

根據核苷酸全序列分析，基因組有兩個開放閱讀框(ORF)，左側閱讀框(LORF)編碼非結構蛋白(Rep1，Rep2)，右側閱讀框(R0RF)編碼3種核衣殼蛋白VP1、VP2、VP3，這3種蛋白起始密碼子位于不同部位，但終止密碼子處于同一位置。關于MDPV對其結構蛋白說法不一，法國學者C.LeCall－Recule等［14］(1994)進行SDS－PAGE 電泳時，發現在51kD 左右處有1條淡染的蛋白帶;匈牙利學者Z.Zadori［6］(l995)根據蛋白凝膠電泳分析，MDPV 有3條結構多肽，分子量分別為VP191kD、VP278kD、VP358kD。而我國孟松樹等［15］(1994)、王永坤等［16］(2004)研究表明，MDPV 有4條結構多肽，分別為VP1、VP2、VP3、VP4，分子量分別為VP189kD、VP268kD、VP358kD、VP4為40kD。其中，VP3為主要結構多肽，占總含量的78.5%，而VP1含量為9.4%，VP2為7.2%，VP4為4.9%。GPV出現3條結構多肽，即VP1分子量為85000，VP2為61000，VP3為57500。其中，VP3為主要結構多肽，占總含量的79.9%，而VP1為8.3%，VP2為11.8%。Chapaman等［17］(1993)分析了幾種細小病毒粒子核衣殼，發現GPV、MDPV 位于病毒粒子表面的VP3多肽略有差異。最大不同之處是位于VP2、VP3啟動子之間162位和178位氨基酸，而其蛋白分子差異不明顯。張建珍等［18］也報道MDPV、GPV 有一定的交叉反應性，兩者的共同抗原基因主要位于VP3上，而主要差異存在于VP1和VP2。Chu等［19］發現，GPV與MDPV 差異最多的序列集中于VP3的203－266及482－534位的氨基酸殘基(VP1的401－464和680－732位氨基酸殘基)。黎明等［20］采用生物信息學方法，預測MDPV和GPV 非結構蛋白可能發生交叉反應的區段為AA503－509。衣殼蛋白可能發生交叉反應的區段為AA321－325、426－430、540－544和685－691。

3 鑒別診斷方法

3.1 動物感染試驗

MDPV 只能感染番鴨及番鴨源細胞，而GPV既能感染鵝，又可以感染番鴨及其體外培養細胞［21］。林世棠［22］、程由銓等［23］將MDPV 經各種途徑接種雛番鴨、雛半番鴨、雛鵝、5日齡莆田黑鴨、6日齡櫻桃谷鴨、北京鴨和雜種鴨，只有雛番鴨于接種后3～7 d 出現與自然患病相似的臨床癥狀，發病率為52.6%，致死率為47.4%，其他水禽觀察20 d 均健活。Glavits等［24］將3株從水禽分離的細小病毒(兩株為鵝細小病毒，1株為番鴨細小病毒)人工感染3周齡的雛鵝和雛番鴨，結果3株細小病毒均能引起雛番鴨發病，而兩株鵝細小病毒僅能使雛鵝感染發病。

3.2 血清學試驗

王永坤等［4］采用交叉免疫轉印試驗發現，MDPV的多抗與MDPV、GPV 都出現了兩條反應帶VP3、VP2;GPV的多抗和MDPV 只有1條反應帶VP3，與GPV 出現3條反應帶VP1、VP2、VP3;MDPV 單抗僅識別MDPV和GPV的VP3，GPV 單抗在識別GPV VP3和VP2的同時，還識別MDPV的VP3。說明MDPV和GPV的共同抗原主要在占整個衣殼蛋白比例大的VP3上，兩者的VP1和VP2存在差異。程由銓等［25］(1997)、胡奇林等［26］(2000)通過ELISA、FA、NT、AGP、LPA 試驗對番鴨細小病毒和鵝細小病毒抗原進行分析，番鴨細小病毒單抗只與番鴨細小病毒發生特異性反應，與小鵝瘟病毒不發生特異性反應;小鵝瘟病毒單抗只與小鵝瘟病毒發生特異性反應，不與番鴨細小病毒發生特異性反應，表明兩者在抗原結構上存在顯著差異，同時明確了送檢病料中以肝、脾組織為首選材料。抗原性上的高度同源給用血清學方法鑒別診斷這兩種疾病造成了困難，在ELISA、FA、NT和LA等血清學檢測方法中，只有應用MDPV和GPV 克隆抗體才能將這兩種病毒區分開來。

3.3 PCR 技術

因GPV和MDPV的NS 基因酶切位點有較大差異，Sirivan等［27］(1998)對來自泰國的17個毒株進行了PCR 擴增和DNA 分子雜交后，采用限制性內切酶消化PCR 產物，有2株病毒不同于另外的15株，兩株病毒無HincⅡ和Bg Ⅲ，而有EcoR Ⅰ位點，采用限制性片段長度多態性PCR－RFLP(Polymerase Chain Reaction－Restriction Fragment Length Polymorphism)分析PCR 產物可用于區分MDPV和GPV。

婁華等［28］(2000)比較了GenBank中MDPV和GPV的基因序列，并針對這兩種病毒NS 基因序列的相同區段，分別設計了兩對PCR 引物。引物LHMP1/LHMP2只特異地擴增MDPV，而引物LHGP1/LHGP2也只特異性地擴增GPV，并且兩對引物均擴增出約720 bp的長度序列，為兩種疾病的準確、快速鑒別診斷奠定了基礎。胡奇林等［29］(2001)在MDPV和GPV 基因組保守區設計了1對通用引物(PC1/PC2)，在MDPV和GPV 基因組的非同源區設計了1對MDPV 特異引物(PS1/PS2)，建立了能對番鴨胚尿囊液和細胞培養液中的MDPV和GPV 進行快速診斷和鑒別診斷的PCR 檢測技術。季芳等［30］(2003)在NS 區設計了1個通用引物PVC，在MDPV、GPV 非同源區設計了各自的特異性引物MDPVdn、GPVdn，其中PVC/MDPVdn能特異鑒別MDPV的存在，PVC/GPVdn 能特異鑒別GPV的存在，若將3種引物置于同一反應體系中，能鑒別兩種病毒同時存在。劉家森等［31］(2007)、季艷菊等［32］(2007)根據GPV和MDPV 基因組的非同源序列，分別設計了針對GPV和MDPV的引物。但所設計引物僅能擴增特定病毒的核酸片段，對其他病毒核酸沒有擴增。賀娟［7］(2007)在VP1基因中尋找同源性較低的兩處，設計的引物能特異性地擴增出GPV的條帶，而對照毒株不能擴增出470 bp的條帶。鮮思美［33－34］(2009，2010)針對兩種病毒NS和VP1基因序列的相同區段設計了兩對引物，建立了番鴨細小病毒與鵝細小病毒PCR 鑒別診斷方法;并設計了針對GPV NS和MDPV NS2－ VP1基因片段的兩對引物，建立了能同時檢測這兩種病毒的雙重PCR。

4 小結

鵝細小病毒與番鴨細小病毒在病毒大小、形態結構、理化特性、核酸類型、免疫學特性等方面極為相似。兩者的差異主要表現為:(1)致病特性，MDPV 僅感染雛番鴨，而GPV可感染雛番鴨和雛鵝;(2)抗原性方面，MDPV與GPV 用常規血清學作交叉和試驗，有較明顯的交叉保護作用，但用單克隆抗體作ELISA、FA等發現有不交叉的抗原成分;(3)MDPV和GPV 在核酸序列上有明顯差異，可針對兩種病毒的非同源區設計引物，采用PCR 技術對這兩種疾病進行鑒別診斷。除此之外，也可采用限制性內切酶技術、PCR 產物結合測序的方法和PCR－RFLP對這兩種細小病毒進行鑒別診斷。

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