可樂豬RYR1基因的群體遺傳特性分析*

張培，惠嫣婷，潘蘭兵，劉若余

(貴州大學動物科學學院，高原山地動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室，貴州貴陽 550025)

豬應激綜合癥(Porcine Stress Syndrome，PSS)是豬在非特異性因子(運輸、高溫、合群等)作用下，發生的惡性高熱(體溫驟升至42～45℃)、呼吸急促、心跳過速、肌肉強直、后肢呈現痙攣性收縮、突然死亡、肉質變劣等征候群。PSS 易導致部分豬因應激而產生PSE 肉甚至死亡，給養豬業造成巨大的經濟損失。據研究，PSS 主要受常染色體上隱性基因(Haln)控制，隱性純合體表現對氟烷麻醉敏感，因而稱為氟烷基因。Knudson等認為，蘭尼啶受體(Rynodine Receptor，RYR1)基因是氟烷基因的主要候選基因［1］，RYR1基因cDNA中C1843→T1843堿基變異使氨基酸序列中第615位處的精氨酸變為胱氨酸［2］，引起蘭尼啶受體發生結構和功能的改變，導致在應激狀態下肌肉組織中Ca2+大量非正常釋放，引起豬出現PSS［3－4］。研究顯示，C1843→T1843變異導致了HhaI 酶切位點(5’GCG↓C3’，HalN)的改變，從而使正常豬和應激敏感豬RYR1基因的酶切片段出現多態，因此，目前多利用聚合酶鏈式－限制性片段長度多態性(PCR－RFLP)技術對該基因進行檢測。

可樂豬是國家級保護的優良地方品種，主產于貴州省畢節市的喀斯特高寒山區，耐粗飼，抗逆性強，并且肉質優良，肉味鮮美，在部分肉質指標上優于香豬［3］，是云南宣威火腿和威寧火腿的主要加工原材料。為開發利用可樂豬的優良種質特性，本文采用PCR－RFLP 技術對可樂豬的氟烷基因進行檢測，以了解氟烷基因在可樂豬群體中的分布情況，為可樂豬的保種、選育和開發利用提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料

試驗所用的45份可樂豬耳組織樣均采自畢節地區可樂豬保種場。用耳號鉗取豬耳緣組織，浸泡于75%酒精溶液中，－20℃保存備用。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取采用酚－氯仿抽提法提取豬基因組DNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其純度后－20℃保存備用。

1.2.2 引物設計與PCR 反應參照文獻［5］中的引物序列，上游引物F 5’TCCAGTTTGCCACAGGTCGTACCA3’和下游引物 R 5’ATTCACCGGAGTTTAGTCTCTGA3’由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

PCR 反應體系:上、下游引物(10 pmol/μL)各1.5μL，DNA 模板2μL，2×Taq PCR MasterMix 12.5μL，加ddH2O 至25μL;反應條件:預變性94℃4 min→(變性94℃50 s→退火58.2℃45 s→延伸72℃50 s)35個循環→延伸72℃10 min。PCR 產物利用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1.2.3 RFLP 分析酶切總反應體系20μL:PCR產物8μL ，限制性內切酶HhaI 1.5μL(10U/μL)，緩沖液M 3μL，ddH2O 7.5μL ，37℃恒溫過夜。酶切產物用10%聚丙烯酰胺凝膠電泳進行檢測。

1.2.4 測序分析在進行RFLP 檢測分離出不同基因型個體后，每種基因型隨機抽取3個樣本進行PCR 擴增及瓊脂糖凝膠電泳檢測，然后送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序分析。

2 結果與分析

2.1 PCR 擴增

經過35個循環的PCR 擴增后，取出5μL的擴增產物進行1%的瓊脂糖凝膠電泳分析，結果如圖1所示。從圖1可知，在659 bp 處出現單一的特異性條帶，與目的片段大小相符，可用于后續試驗。

圖1 RYR1基因PCR 擴增結果Fig.1 Amplification result of RYR1gene

2.2 RFLP 檢測

對擴增的PCR 產物用限制性內切酶HhaI 進行消化，酶切結果用10%聚丙烯凝膠電泳檢測，結果見圖2。從圖2可知，在45個可樂豬樣本中僅檢測出兩種基因型，沒有發生突變的HalNN型(片段大小為493 bp和166 bp)有41頭，有1個等位基因發生變異的HalNn型(片段大小為659 bp、493 bp和166 bp)個體有4頭。

圖2 RYR1基因的RFLP 檢測結果Fig.2 RFLP detection results of RYRl gene

2.3 測序結果

對已進行RFLP 檢測的不同基因型樣本進行測序驗證及序列比對，結果見圖3。測序結果顯示，兩種基因型個體在HhaI 酶切位點處發現了C→T的堿基變異，其中HalNN基因型個體僅出現了堿基C的單一峰，而HalNn基因型個體的測序結果中顯示出C/T的雜合峰，進一步證明了本研究中RFLP 檢測結果的可靠性。

圖3 不同基因型RYR1基因的測序檢測結果Fig.3 Sequencing results of RYR1 gene in different genotypes

2.4 RYR1基因的基因型頻率和基因頻率

根據PCR－RFLP 檢測結果判定基因型，并計算基因型頻率和基因頻率，如表1所示。由表1可知，RYR1基因的基因型頻率和基因頻率呈現偏態分布，HalNN基因型個體占多數為45頭，頻率為0.9111;而HalNn基因型個體較少為4頭，頻率為0.0889。因此，HalNN在可樂豬群體中為優勢基因型。從基因頻率來看，等位基因HalN的頻率為0.9556，等位基因Haln的頻率為0.0444，HalN為優勢等位基因。

表1 RYR1基因的基因型頻率和等位基因頻率Tab.1 Genotype frequencies and allele frequencies of RYR1 gene

2.5 RYR1基因的群體遺傳特性

對可樂豬RYR1基因的雜合度、多態信息含量等統計結果見表2。由表2可知，可樂豬RYR1基因的純合度較高，為0.9151;從多態信息含量來看，可樂豬處于低度多態(PIC＜0.25)。適合性檢驗表明，可樂豬RYR1基因頻率不符合期望比例(P＜0.05)，即可樂豬群體在該位點處偏離了Hardy－Weinberg 平衡。

表2 可樂豬RYR1基因的純合度、雜合度、有效等位基因數、多態信息含量和χ2值Tab.2 Homozygosity (Ho)，Heterozygosity(He)，Effective number of alleles(E)，Polymorphism Information Content(PIC)and Chi square(χ2)of RYR1 gene in Kele pigs

3 討論

本研究利用PCR－RFLP 技術對45頭可樂豬進行了氟烷基因檢測，結果未發現隱性純合個體(Halnn)，僅檢測出4頭雜合體(HalNn)，這與學術界普遍認為的氟烷基因在中國地方豬種中只少量存在的觀點相似［6－7］。本研究中Haln的基因頻率為0.0444，大于朱鋒釗等報道的結果［8］，這可能是由于選取了不同的可樂豬群體所致。據報道，氟烷基因主要分布在國外的一些瘦肉型豬種中。研究顯示，德國、比利時長白以及皮特蘭陽性率較高，可達70～100%，而杜洛克、大白豬、約克夏和漢普夏陽性率較低，一般低于10%。本研究在可樂豬群體中未檢測出氟烷陽性個體，說明近年來對可樂豬的保種選育工作具有一定的成效。

氟烷基因對豬肉質影響較大，但研究表明雜合個體在生長、胴體和繁殖性狀上優于顯性純合體和隱性純合體［9］。因此，就目前市場需求來看，單純地剔除氟烷基因是不利的，應充分利用雜合個體的優勢。可以考慮通過合理的選種選配，提高可樂豬群體中雜合個體所占比例，以提高可樂豬的胴體品質，同時避免隱性純合個體的產生，以控制豬應激綜合癥導致的劣質豬肉。

［1］KNUDSON C M，MICKELSON J R，LOUIS C F，et al.Distinct immunopeptide maps of the sarcoplasmic reticulum Ca2+release channel in malignant hypethermia［J］.J Biol Chem，1990，265(5):2421－2424.

［2］FUJII J，OTSU K，ZORATO F，et al.Identifaction of muation in porcine ryandine receptor associated with malignant hyperthermia［J］.Science，1991，253:448－451.

［3］STINCKENS A，VAN DEN MAAGDENBERG K，LUYTEN T.The RYR1 g.1843C＞T mutation is associated with the effect of the IGF2 intron3－g.3072G＞A mutation on muscle hypertrophy［J］.Anim Genet，2007，38(1):67－71.

［4］BALATSKIL V N，METLITSKAIA E N.DNA diagnosis of porcine stress syndrome and RYRI genotype association with viability of young pigs［J］.Tsitol Genet，2001，35(3):43－49.

［5］熊遠.豬生化及分子遺傳試驗導論［M］.北京:中國農業出版社，1999:35.

［6］丁能水，黃路生，任軍，等.江西省主要外來豬種氟烷基因分布頻率的初步研究［J］.江西農業大學學報，1999，21(4):555－557.

［7］劉銳，郁輝.嘉興黑豬氟烷基因頻率檢測初報［J］.安徽農業科學，2007，35(18):5442－5442.

［8］朱鋒釗，楊春苗，樊翠華，等.七個貴州地方豬種RYR1基因突變的分布［J］.畜牧與獸醫，2009，41(4):52－55.

［9］杜曉婷，劉銳，張水明，等.PCR－RFLP 技術檢測嘉興鳳橋種豬氟烷基因［J］.安徽農業科學，2009，37(24):11437－11438.