響應曲面法優(yōu)化紅菜苔多酚提取工藝的研究

楊紅，操德群，朱江，謝順嵐，李建華

（特色果蔬質量安全控制湖北省重點實驗室，湖北孝感 432000）

紅菜苔（Brassica.campestris L.var.purpurea Baileysh）紅菜苔又名蕓菜苔、紫菜苔等，是十字花科蕓苔屬蕓苔種白菜亞種的一個變種，廣泛種植于我國南方地區(qū)，因湖北武漢市洪山區(qū)所產的紅菜苔久負盛名，因此產自該地的紅菜苔又名“洪山菜苔”；紅菜苔外皮及葉脈均呈紫紅色，莖肉淺綠色；該蔬菜不僅適應性強、產量高，其且營養(yǎng)全面，含有豐富的蛋白質、脂肪、碳水化合物、維生素、和人體必需的微量元素等[1]，在唐代曾被封為“金殿玉菜”。

植物多酚（plant polyphenol）又名植物單寧（vegetable tannin），是一類廣泛存在于植物體內的復雜酚類次生代謝物質，包括原花青素類、黃酮醇類、酚酸類、兒茶素類、花青素類和二羥查耳酮類等，主要存在于植物的皮、木、葉、根、果實等部位[2-4]。根據(jù)來源的不同，植物多酚亦被稱為如茶多酚[5]、葡多酚[6]、蘋果多酚[2]等。植物多酚具有抗氧化、抑制酶活性、抑菌、抗致突變、消炎、降血壓等多種生物活性[7]。

由于紅菜苔的葉子和莖皮的適口性不佳，許多人在食用時會剝去莖皮，并將其葉子幾乎全丟掉，只留頂尖的花和嫩葉，這樣就會產生很多的莖皮和葉子。由于紅菜苔的莖皮和葉片中富含植物多酚，采用適當?shù)墓に嚕崛〖t菜苔莖皮和葉片中的多酚，對于充分開發(fā)利用紅菜苔，具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 原料試劑與儀器

1.1.1 原料

新鮮紅菜苔，產自湖北省孝感市。

1.1.2 試劑

沒食子酸、Folin-Ciocalteau 試劑、蒸餾水、乙醇、碳酸鈉溶液。

1.1.3 儀器

752 N 紫外可見分光光度計：上海精密科學儀器有限公司；康麗SO200-A 多功能攪拌機：順德市寶鋒電器廠；檢測檢驗篩：浙江上虞市龍翔精密儀器廠；SHZ-ⅡD 型循環(huán)水真空泵：上海來榮生化儀器廠；202-2 型干燥箱：上海市實驗儀器總廠；PL203 型電子天平：梅特勒-托利多儀器上海有限公司。

1.2 方法

1.2.1 試驗設計

用Design-Expert 軟件中的中心組合設計（Central Composite Design，CCD）模塊中的二次回歸正交旋轉組合設計，設計了一組四因素五水平的共計31 次的實驗（full CCD 設計），其中析因部分實驗次數(shù)為16 次，星點數(shù)為6，保證均一精密性的中心點重復次數(shù)手動調整為7，本試驗設計的因素及水平見表1。

表1 中心組合設計因素水平表Table 1 Central Composite Design factors levels table

1.2.2 紅菜苔總多酚的提取

將紅菜苔葉及皮曬干至手捏即碎，粉碎過80 目篩，準確稱取1.00 g 干粉末，按照中心組合設計試驗中設置的不同提取條件分別進行浸提，離心收集各個提取條件下得到的提取液，備用。每個處理重復3 次。

1.2.3 標準曲線制作與紅菜苔總多酚的測定

參照鄧義書等的方法，測定并繪制沒食子酸標準曲線[8]，得吸光度值y 與沒食子酸標準溶液濃度（x，mg/mL）之間的回歸方程為y=0.055 2x-0.030 5，決定系數(shù)R2值為0.992 4。這表明，沒食子酸質量濃度與吸光度值具有良好的線性關系。

取40 μL 紅菜苔葉和皮的多酚提取液于10 mL 試管中，加水3.16 mL，加200 μL Folin-Ciocalteau 試劑，混勻，在30 s 至8 min 內加入600 μL 2 % 碳酸鈉溶液，混勻，于20 ℃保溫2 h，在765 nm 波長下比色，每樣重復測量3 次，取平均值。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)采用Design Expert 軟件進行多元回歸及方差分析。

2 結果

2.1 試驗結果

試驗結果如表2 所示。

表2 響應曲面分析試驗設計與結果Table 2 Design and results of response surface analysis

2.2 模型的建立及方差分析

利用Design—Expert 軟件對試驗結果進行回歸及方差分析（分析結果見表3），發(fā)現(xiàn)本研究符合二次方模型，經(jīng)過響應曲面法的擬合計算得出該模型的決定系數(shù)R-Squared 為0.968 2，表明該模型具有較高的可信度；校正系數(shù)RAdj=0.940 3 表明在多酚含量總的變異中，有94.03%是由獨立變量引起的。R-Squared 失擬項用來檢測回歸模型與實際試驗值的擬合程度的好壞。如果失擬項顯著，說明影響響應值的還有除溫度、保溫時間、乙醇濃度以及液固比以外的其它因素。失擬項的F=0.87，對應的P=0.595 9＞0.05，失擬項不顯著，從而表明該模型能夠對紅菜苔多酚的提取進行預測和分析。圖1 分析了模型的適應性，由圖1 也可知，試驗值大致對稱分布于預測值兩側，與預測值也比較接近，這說明該模型適應性較高。

圖1 試驗值與預測值對比圖Fig.1 Contrast diagram between actual values and prediction

紅菜苔多酚提取的方差分析結果見表3。

表3 二次多項式模型方差分析表Table 3 Variance analysis of quadratic multinomial model

通過方差分析可對模型的精確性做進一步的判斷，該模型的F 值為34.76，因誤差而接受該模型的概率不到0.000 1，這表明模型的可信度很高，具有重要的參考價值；如果以0.05 作為顯著性標準的話，在該模型中，A、C、D、AD、BC、CD、C2、D2是顯著的模型項，表明溫度、乙醇濃度和液固比是影響紅菜苔多酚提取的關鍵性因素。

去掉不顯著的交互作用項，手動優(yōu)化可得簡化的回歸方程為：

優(yōu)化后模型的F 值52.32，對應的P ＜0.000 1，因誤差而接受該模型的概率不到0.000 1，失擬項的F=0.92，對應的P=0.588 1＞0.05，失擬項不顯著；決定系數(shù)R-Squared 為0.957 3，校正系數(shù)RAdj為0.939 0，優(yōu)化后的決定系數(shù)與校正系數(shù)之差小于優(yōu)化前兩者之差，表明優(yōu)化后的回歸方程具有更高的可信度。

2.3 響應曲面分析

利用Design Expert 7.0.0 軟件對表2 數(shù)據(jù)進行二次多元回歸擬合，所得到的二次回歸方程的等高線及其響應面見圖2、圖3 和圖4。

圖2 提取溫度和液固比的等高線和響應曲面圖Fig.2 Contour figure and response surface graph between extraction temperature and liquid-solid ratio

圖3 提取時間和乙醇濃度的等高線和響應曲面圖Fig.3 Contour figure and response surface graph between extraction time and ethanol concentration

圖4 乙醇濃度和液固比的等高線和響應曲面圖Fig.4 Contour figure and response surface graph between ethanol concentration and liquid-solid ratio

通過二次模型所得到的等高線及響應曲面來判斷試驗因素之間的交互作用強度以及確定各因素的最佳水平范圍。曲線越陡，說明因素間的交互作用越強；圖形中曲面顏色越深的區(qū)域，說明結果越顯著。

由圖2 可知：曲線比較陡，表明提取溫度（A）和液固比（D）之間的交互作用顯著；當提取時間固定為2.5 h，乙醇濃度固定為65.0%，在提取溫度不變的條件下，液固比在20～50∶1 的范圍內，隨著液固比值的升高，紅菜苔多酚提取量逐漸增加。

由圖3 可知：曲線很陡，近似直線，表明提取時間（B）和乙醇濃度（C）間的交互作用極顯著；當提取溫度固定為45.5 ℃，液固比固定為35∶1 時，在提取時間不變的條件下，乙醇濃度值在50%～80%范圍內，隨著濃度的升高，紅菜苔多酚提取量逐漸增加，在65%附近達到最大值，隨后隨著乙醇濃度的增加，紅菜苔多酚提取量逐漸減少。

由圖4 可知：該曲線沒有圖2 和圖3 陡峭，但仍有一定的陡峭度，表明乙醇濃度（C）和液固比（D）間的存在著一定的交互作用；當提取溫度固定為45.5 ℃，提取時間固定為2.5 h，在乙醇濃度不變的條件下，液固比在20～50∶1 的范圍內，隨著液固比值的的升高，紅菜苔多酚提取量逐漸增加。

上述等高線和響應曲面分析結果與表3 所示方差分析結果是一致的。

2.4 參數(shù)優(yōu)化與驗證

R 的物理意義是每克紅菜苔皮和葉混合物提取多酚的毫克數(shù)，在Design Expert 7.0.0 軟件的優(yōu)化（optimization）模塊中，將優(yōu)化標準設置為最大值，求解得R 的最優(yōu)值是1.529 3 mg/g，預測的最佳實驗條件為：溫度59.68 ℃，提取時間2.67 h，乙醇濃度64.60%，液固比53.57∶1（mL/g）。為檢驗優(yōu)化條件的準確性，按照上述優(yōu)化過的工藝參數(shù)，重復試驗3 次，得其平均值為1.513 6 mg/g，與預測值相差1.027%，實驗值與預測值基本吻合。

3 結論

1）經(jīng)過響應曲面法擬合計算得出二次方模型的決定系數(shù)R-Squared 為0.968 2，校正系數(shù)RAdj=0.940 3，通過方差分析可對模型的精確性做進一步的判斷，該模型的F 值為34.76，因誤差而接受該模型的概率不到0.000 1，具有較高的可信度，能夠對紅菜苔多酚的提取進行預測和分析。

2）響應曲面分析表明，提取溫度、乙醇濃度和液固比對紅菜苔葉和皮中多酚得率有極顯著的影響（P<0.01），計算得到的回歸方程為：R=-3.494 82-0.005 7A+0.398 9B+0.109 3C+0.037 1D+0.003 1AD-0.006 0BC-0.0002CD-0.0007C2-0.0004D2，決定系數(shù)為0.9573。

3）應用響應曲面分析法（RSA），確定從紅菜苔葉和皮中用乙醇浸提多酚的最優(yōu)提取條件為：提取溫度59.68 ℃，提取時間2.67 h，乙醇濃度64.60%，液固比53.57∶1（mL/g），預測最優(yōu)提取量是1.529 3 mg/g。用上述優(yōu)化過的工藝參數(shù)進行提取，得其平均值為1.5136mg/g，與預測值相差1.027%，實驗值與預測值基本吻合。這表明采用響應面曲優(yōu)化的紅菜苔多酚乙醇浸提工藝，對于利用紅菜苔葉和莖皮提取多酚具有一定的指導意義。

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