云南麗江產白雪茶多糖提取工藝及抗氧化作用

林春榕，羅永會，張翠香，韓紅，胡志強，左紹遠

（1.大理學院基礎醫學院，云南 大理 671000，2.大理學院基礎醫學院2004級醫學檢驗班，云南 大理 671000）

白雪茶（Thamnolia vermicularis（Sw.）Ach），又稱地衣，太白茶，為地衣類地茶科地茶屬植物，全株呈白色或灰綠色，管狀，長3 cm～7 cm，直徑3 mm～5 mm。雪茶為耐寒植物，生長于海拔4 000 m 以上的高山地區，在云南的迪慶、麗江、大理蒼山等地區分布較廣泛，在滇西北地區一直作為一種傳統飲品及旅游食品使用。雪茶性寒，具有清熱、消暑、生津止渴等功效[1]，對中暑、肺熱咳嗽、高血壓及肥胖等有一定防治作用[1]。多糖是一類結構復雜的生物大分子物質，具有多種復雜而廣泛的生物學活性[2-4]，已成為功能性食品新資源的研究開發的熱點之一。我們前期研究表明，白雪茶多糖具有促進免疫功能的作用[5]。為綜合開發利用云南白雪茶資源，我們對云南麗江產白雪茶中多糖的分離提取工藝及其在體外抗氧化活性進行了研究，以期為研究開發白雪茶深加工食品、擴大白雪茶的用途提供參考。

1 材料

1.1 試劑與原料

D-葡萄糖標準品：Sigma 公司；硫酸亞鐵、水楊酸、雙氧水、三羥甲基氨基甲烷、無水乙醇、丙酮、乙醚、正丁醇、三氯甲烷、硫酸等試劑：均為國產化學分析純。白雪茶，云南麗江紅葉土特產經營公司產品（批號：20101102）。

1.2 儀器

HH-W420/600 恒溫水浴箱：金壇市瑞華儀器有限公司；AG 135 電子天平：瑞士梅特勒-托利多公司；RE-52A 型旋轉蒸發儀：上海亞東生化儀器廠；FD-1型冷凍干燥機：北京博醫康技術有限公司；UV2550 型紫外可見分光光度計：日本島津蘇州儀器有限公司；TDL-5-A 低速臺式大容量離心機：上海安亭科學儀器純廠。

2 方法

2.1 標準曲線的繪制[6]

精密稱取105 ℃干燥至恒重的葡萄糖標準品100.0 mg 置100 mL 容量瓶中，用蒸餾水溶解后，稀釋至100 mL 定容，得葡萄糖標準儲備液。吸取儲備液10.0 mL 置100 mL 容量瓶中，用蒸餾水定容，得葡萄糖標準應用液（100 μg/mL）。精密吸取應用液0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60、0.70、0.80 mL，分別置于具塞試管，補蒸餾水至總體積2.0 mL，加6.0 %苯酚試劑1.0 mL后，各管迅速加濃H2SO45.0 mL，搖勻，沸水加熱10 min，迅速流水冷卻，另取2.0 mL 蒸餾水，同法操作，加入試劑作空白對照，在490 nm 測定吸光度。以吸光度為縱坐標，葡萄糖質量濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

2.2 白雪茶多糖的提取工藝流程與多糖提取率的測定

稱取白雪茶200.0 g，粉碎后用石油醚、95%乙醇各回流1 次，每次2 h。濾渣加蒸餾水水浴浸提2 次，合并濾液，減壓濃縮至適當體積后加95%乙醇至乙醇體積分數為75%醇沉，置4 ℃過夜，離心，沉淀用Sevag法脫蛋白[6]至280 nm 無明顯蛋白吸收峰后，加95%乙醇至乙醇體積分數為80%醇沉，沉淀用蒸餾水透析24 h，醇沉，沉淀依次用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌3次，-20 ℃冷凍干燥至恒重，得白雪茶粗多糖樣品，置玻璃干燥器中備用。精密稱取白雪茶粗多糖樣品100.0 mg，按2.1 方法同法操作，測定吸光度。根據葡萄糖標準曲線計算出粗多糖樣品中多糖的質量分數。按公式：多糖提取率（%）=[多糖質量分數（%）×粗多糖樣品質量（g）/蜂花粉干重質量（g）]×100 計算多糖提取率。

2.3 白雪茶多糖提取的正交試驗

本實驗選擇提時間、提取溫度，料液比為觀察因素，采用L9（34）正交試驗表設計試驗（見表1），以多糖提取率為考察指標，篩選最佳提取條件。

表1 白雪茶多糖提取正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for extraction Thamnolia vermicularis polysaccharide

2.4 白雪茶多糖對清除羥基自由基（·OH）的作用

[7-8]方法進行。將多糖樣品配制為0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60 mg/mL 質量濃度溶液，各取1.0 mL，分別加入9.0 mmol/L FeSO4、9.0 mmol/L水楊酸-乙醇各1.0 mL，對照組以蒸餾水1.0mL 代替多糖溶液。最后加8.8 mmol/L H2O2啟動反應，37 ℃水浴反應0.5 h 后，以蒸餾水調零，在波長510 nm 下測定吸光度。為扣除多糖溶液本身可能產生的吸光值，以不加H2O2的多糖溶液作為本底管。以VC作陽性對照品，臨用前用蒸餾水配制成與多糖溶液相同的質量濃度。同法操作，進行對照試驗。每個質量濃度做3 個平行管，結果取平均值。按清除率（%）=[（A0-Ax-Ax0）/A0]×100 計算清除率。式中：A0為對照組吸光度值，Ax為多糖樣品吸光度值，Ax0為本底管吸光度值。

2.5 白雪茶多糖對清除超氧陰離子自由基的作用

采用鄰苯三酚自氧化法進行測定[9-10]。多糖樣品配制同2.4。取pH8.2 的Tris-HCl 緩沖液0.50 mL 于具塞試管，加不同質量濃度的多糖液1.0 mL 置25 ℃水浴保溫20 min 后，再加入在25 ℃預熱的5.0 mmol/L 鄰苯三酚溶液0.5 mL，混勻后25 ℃水浴4 min，快速搖勻，在325 nm 處，以pH 8.2 的Tris-HCl 緩沖液調零，每隔30 s 測定1 次吸光度，連續測定4min，計算加入多糖樣品后的自氧化速率△Ax。自氧化速率=（最后1次測定值-第1 次測定值）/4。空白對照組以1.0 mL 蒸餾水溶液代替多糖樣品，同法操作，測定自氧化速率△A0。同法以VC作為陽性對照試驗。按公式：清除率（%）=[（△A0-△Ax）/△A0]×100 計算清除率。

3 實驗結果

3.1 標準曲線的繪制

以吸光度為縱坐標，葡萄糖濃度為橫坐標，繪制標準曲線，計算出回歸方程為：A=0.006C-0.005，R2=0.998 2，表明葡萄糖質量濃度在10 μg/mL～80 μg/mL范圍內與吸光度值有較好的線性關系。

3.2 白雪茶多糖提取正交試驗結果

白雪茶多糖提取正交試驗結果見表2、表3。

表2 白雪茶多糖提取正交試驗結果Table 2 Results of orthogonal experiments for extraction Thamnolia vermicularis polysaccharide

表3 白雪茶多糖提取正交試驗方差分析表Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments for extraction Thamnolia vermicularis polysaccharide

由表2 可直觀看出，正交試驗極差R 的大小順序為RB＞RA＞RC，即對多糖提取率的影響依次為提取溫度＞提取時間＞料液比。方差分析表明，提取溫度、提取時間對提取率的影響有顯著性差異（P＜0.05），而料液比影響較小（P＞0.05）。考慮到后續減壓濃縮等因素，料液比不宜過大，故本實驗選擇白雪茶多糖的最佳提取條件為A3B3C2，即提取溫度為80 ℃，浸提時間為12 h，料液比為1∶15。為進一步驗證A3B3C2提取條件，本實驗按此工藝對白雪茶多糖提取進行了3 組平行試驗，結果表明，3 次試驗的多糖提取率分別為2.605 %、2.614%、2.607%，平均提取率2.609%（RSD=1.48%）。表明A3B3C2工藝組合穩定可行。

3.3 白雪茶多糖對清除羥基自由基（·OH）的作用

白雪茶多糖對清除羥基自由基（·OH）的作用結果，見圖1。

圖1 不同質量濃度白雪茶多糖和VC對·OH 的清除率Fig.1 Different mass concentration of Thamnolia vermicularis polysaccharide and vitamin C on the effect of scavenging hydroxyl free radical

結果表明，在質量濃度低于0.30 mg/mL 時，多糖清除·OH 的作用較小，而質量濃度從0.30 mg/mL 增加到0.40 mg/mL 時，清除率從11.02 %迅速升高至36.56%。表明雪茶多糖對清除·OH 的作用有劑量依賴關系，在40.0 mg/mL～0.60 mg/mL 劑量范圍內，表現出一定的劑量效應關系。

圖2 不同質量濃度白雪茶多糖和VC對·的清除率Fig.2 Different mass concentration of Thamnolia vermicularis polysaccharide and vitamin C on the effect of scavenging superoxide anion free radical

4 討論

參考文獻：

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[4]董莎莎,左紹遠.花粉多糖抗腫瘤作用機理研究進展[J].中國民族民間醫藥,2009,18(3)：29-30

[5]張丙燦,左紹遠,董莎莎.雪茶多糖對免疫功能的影響[J].亞太傳統醫藥,2010,6(3)：11-13

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