酶聯免疫法檢測進出口肉制品中的萊克多巴胺

柴銘駿，惠洪文，黃晨

（1.天津出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢測中心，天津 300461；2.內蒙古滿洲里出入境檢驗檢疫局，內蒙古 滿洲里 021008）

萊克多巴胺是一種苯基乙醇胺類藥物，屬于β-腎上腺素興奮劑，作為“瘦肉精”的替代品它能改變養分的代謝途徑，促進動物肌肉生長，促進動物體蛋白質沉積，特別是骨骼肌中蛋白質的合成，抑制脂肪的合成和積累，從而改善胴體品質，使生長速度加快[1-2]。但是，人類食用了殘留有萊克多巴胺的食品動物后，會出現不同程度的中毒現象。我國農業部已在176 號公告《禁止在飼料和動物飲用水中使用的藥物品種目錄》中將其列入了禁用清單。在歐盟等國家，萊克多巴胺已被禁止用作飼料添加劑。

目前關于萊克多巴胺的檢測，最通用的方法是使用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）對樣品進行初篩，再用液相色譜-串聯質譜法（LC-MS/MS）進行確證[3]。ELISA法利用抗原抗體反應原理對目標物進行測定具有快速、靈敏和高通量等特點，且無需昂貴的儀器，是目前檢測部門應用的主要方法[4-6]。本文根據試際檢測經驗和數理統計原理對萊克多巴胺殘留快速檢測試劑的選用以及運用綜合檢測技術手段加強進出口檢驗把關等有關問題進行了探討。

1 材料和方法

1.1 儀器和試劑

12043 萊克多巴胺試劑盒：R-Biopharm；3K30 離心機：SIGMA；ELX800UV 酶標儀：BIO-TEK；API 4000液相色譜－串聯質譜儀：Applied Biosystem；SE812 氮吹儀：Organomation。

乙酸乙酯、乙腈等試劑均為色譜純。試驗中所用的肉、肝臟等樣品均為天津口岸進出口的試際樣品。

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理

取3 g 均質后樣品于螺紋離心管中，加入8 mL 乙腈和1 mL 乙酸乙酯，漩渦混合器充分混合，振蕩30 min（回旋振蕩）。離心：10 min/4 000 g/20 ℃～25 ℃，取4 mL上清液（相當于1 g 樣品）于新離心管中，在60 ℃條件下蒸干。殘留物溶于2mL正己烷（或正庚烷），加入1mL 樣品緩沖液，漩渦混合器混合30 s。離心：10 min/4 000g/20℃～25℃，小心收集下層液體，待ELISA 檢測。

1.2.2 酶聯免疫測定

測定在室溫20 ℃～25 ℃條件下操作，測定之前將試劑盒以及所有試劑在室溫（20 ℃～25 ℃）下放置1 h～2 h。加入100 μL 稀釋后的抗體溶液到微孔底部，在室溫（20 ℃～25 ℃）下孵育15 min，倒出孔中的液體，將微孔架倒置在吸水紙上拍打（每輪拍打3 次）以保證完全除去孔中的液體。用250 μL 洗滌緩沖液充入孔中，再次倒掉微孔中液體，重復操作2 次。加入20 μL 的標準品或按1.2.1 處理的樣品溶液到各自的微孔中。然后加入100 μL 稀釋后的酶標記物到微孔底部，小心充分混合，室溫（20 ℃～25 ℃）下孵育30 min。倒出孔中的液體，將微孔架倒置在吸水紙上拍打（每輪拍打3 次）以保證完全除去孔中的液體。用250 μL 洗滌緩沖液充入孔中，再次倒掉微孔中液體，再重復操作兩次。加入100 μL 底物/發色試劑到微孔中，小心充分混合并在室溫（20 ℃～25 ℃）下暗處孵育15 min。加入100 μL 反應終止液到微孔中。混合好在450 nm 處測量吸光度值。

1.3 結果計算

按下式計算百分吸光度值：

式中：B 為標準溶液或供試樣品的平均吸光度值；BO零標準的標準溶液平均吸光度值；以標準品濃度為橫坐標，以百分吸光度值為縱坐標繪制半對數曲線。

1.4 陽性確認試驗

對于ELISA 陽性的樣品（ELISA 測定大于0.5 μg/kg），按照進出口動物源食品中克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇和特布他林殘留量的測定液相色譜-質譜/質譜法標準SN/T 1924-2011《進出口動物源食品中克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇和特布他林殘留量的測定液相色譜-質譜/質譜法》的方法進行樣品前處理，以液相色譜串聯質譜法（HPLC-MS/MS）進行確證。色譜柱為MG C18柱（100 mm×2.1 mm，5 μm），流動相A 為0.1%的甲酸水溶液，流動相B 為乙腈，梯度洗脫程序為：0 min～7 min，流動相A 由90 %降至25 %，7.01 min，流動相A 升至90%，保持7min。質譜以正離子模式掃描，采用多反應監測（MRM）方式檢測，定量離子對為302.3/164.2，定性離子對為302.3/284.3。方法檢出限為0.1μg/kg。

2 結果與討論

2.1 重復性試驗

選用不同批號的試劑盒，做10 次標準曲線，每次試驗均做平行試驗。典型的ELISA 試劑盒的標準曲線見圖1。

圖1 標準曲線Fig.1 Standard curve

10 次標準曲線的IC50值在0.728 μg/kg～0.934 μg/kg之間，CV 值為5.67%，每次平行標準品間的CV 值在0.3%～7.8%之間，均＜10%。

2.2 回收率和精密度試驗

取若干空白豬肝、豬肉樣品，分別添加萊克多巴胺標準溶液，添加終濃度為0.5 μg/kg、1.0 μg/kg，每種濃度6 個平行，測定3 批。計算測定含量（平均值）、添加回收率及批內與批間變異系數。見表1 和表2。

表1 豬肉樣品準確度和精密度測定結果Table 1 Test results of pork sample accuracy and precision

表2 豬肝樣品準確度和精密度測定結果Table 2 Test results of pork liver sample accuracy and precision

測定結果表明豬肉樣品添加濃度的回收率81.5 %～92.4%、批內變異系數3.65%～8.43%、批間變異系數分別為10.42%和9.43%；豬肝樣品添加濃度的回收率75.6%～86.7%、批內變異系數4.54%～9.87%、批間變異系數分別為7.84%和9.18%。

2.3 確認試驗

采用HPLC-MS/MS 方法對陽性樣品進行確認，結果見表3。

表3 驗證試驗結果Table 3 Verification of the test results μg/kg

從表3 可以看出ELISA 法初篩后為陽性的樣品，經LC-MS/MS 法測定后，ELISA 結果總是高于LC-MS/MS 法測定結果。推測原因可能為，萊克多巴胺在動物體內的代謝速度較快，動物在停藥3 天以后一部分萊克多巴胺就以代謝物的形式存在了，其主要代謝物為萊克多巴胺葡萄糖苷酸；萊克多巴胺葡萄糖苷酸根據代謝位點的不同，分為萊克多巴胺葡萄糖苷酸A、萊克多巴胺葡萄糖苷酸B 和萊克多巴胺葡萄糖苷酸C[7]。文獻提供的試驗數據表明，萊克多巴胺抗體對萊克多巴胺的代謝物存在交叉反應，尤其對萊克多巴胺葡萄糖苷酸C 的交叉反應性非常高。萊克多巴胺初篩檢測中所采用的ELISA 試劑盒生產商提供的數據表明：該抗體對三種不同代謝物的交叉反應率均較高。基于抗體反應的ELISA 初篩檢測方法可以檢出動物肉產品中的萊克多巴胺原藥與代謝物成分，而HPLC-MS/MS只能檢測出樣品中的萊克多巴胺原藥含量，因此目前ELISA 初篩檢測法的結果總是高于HPLC-MS/MS 法，且在代謝物未完全排出之前，隨著停藥期的延長，這種差別愈加顯著。

3 結論

本文采用ELISA 法篩選，LC-MS/MS 法進行確證，可以很好的檢測進出口肉制品中萊克多巴胺的殘留。在實際中由于萊克多巴胺的特殊性，ELISA 方法與儀器法并不能完全符合。為避免漏檢的發生，建議采取以下措施：

1）完善液相色譜-串聯質譜法，使其能檢測萊克多巴胺代謝物。

2）針對進境肉制品中萊克多巴胺用藥量較大，檢出含量較高的情況，應將其列為重點監控對象。

總之，在進行萊克多巴胺的檢測時要注意其檢測的特殊性，確保檢測結果的正確性，保證執法的公正性。

[1]廖峰,李云.酶聯免疫吸附技術在安全檢測中的應用[J].中國飼料,2004,12(6)：41-42

[2]陶軍,肖耀明,黃忠,等.萊克多巴胺殘留檢測方法的研究進展[J].上海畜牧獸醫通訊,2008(6)：8-9

[3]賈濤.酶聯免疫法檢測飼料中的萊克多巴胺的探討[J].新飼料,2007,20(12)：33-35

[4]聶建榮,洪振濤,連槿,等.HPLC-MS/MS 快速檢測動物尿液中的萊克多巴胺和克倫特羅[J].中國獸藥雜志,2008,42(8)：17-20

[5]吳澤君,龍凌云,郭世明.高效液相色譜－串聯質譜法研究豬毛發中克倫特羅和萊克多巴胺的殘留及代謝規律[J].中國獸藥雜志,2010,44(8)：22-26

[6]孔令勇,彭會建.用ELISA 法檢測飼料中萊克多巴胺含量[J].上海畜牧獸醫通訊,2006,16(9)：12-14

[7]Qiang Z,Shentu F,Wang B,et al.Residue Depletion of Ractopamine and Its Metabolites in Swine Tissues,Urine and Serum[J].Agric Food Chem,2007,55(11)：4319-4326