酶制劑對樹莓濁汁飲料中花色苷含量的影響

郭淑文，蘭蓉，夏美茹

（1.內(nèi)蒙古河套大學(xué)，內(nèi)蒙古 巴彥淖爾 015000；2.北京電子科技職業(yè)學(xué)院，北京 100029）

樹莓（Raspberry）又稱覆盆子、托盤、馬林果，薔薇科（Rasaceae）懸鉤子屬（Rubus L.），是多年生小灌木類落葉果樹。樹莓果試色澤鮮艷、風(fēng)味獨(dú)特、柔軟多汁、營養(yǎng)豐富，適合加工果汁和果酒等產(chǎn)品，其紅色與富含的花色苷類化合物有關(guān)。花色苷是一種天然色素，安全、無毒，具有抗氧化、抗突變、降低血清及肝臟中脂肪含量等功能[1-2]，但花色苷的穩(wěn)定性較差，易受外部因素如溫度、光照、pH、金屬離子、氧等而發(fā)生分解或色素沉淀[3-4]。由于花色苷的降解，導(dǎo)致果汁飲料顏色喪失，從而影響了果汁的質(zhì)量和風(fēng)味，因此，如何減緩花色苷的降解成為人們研究的熱點(diǎn)。

利用葡萄糖氧化酶（glucose oxidase，GOD）和過氧化氫酶（catalase，CAT）來減緩樹莓濁汁飲料中花色苷降解速率，使其保持風(fēng)味和色澤的穩(wěn)定性的研究尚未見報(bào)道。本文以樹莓濁汁飲料為原料，在樹莓濁汁飲料貯藏過程中，通過加入葡萄糖氧化酶與過氧化氫酶，研究其對樹莓濁汁飲料中花色苷含量的影響，以期最大限度地減緩花色苷的降解速率，使其最大限度的在果汁貯藏期間保持風(fēng)味和色澤穩(wěn)定性，為樹莓濁汁飲料的貯藏條件選擇提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原材料

樹莓：匯源果汁廠提供（-20 ℃的冰箱保存，備用）。

1.1.2 主要試劑

果膠酶、葡萄糖氧化酶、過氧化氫酶：北京衛(wèi)諾恩生物技術(shù)有限公司；白砂糖：市售；CMC-Na：天津市華東試劑廠；黃原膠、檸檬酸鈉、植酸：華北制藥有限公司；檸檬酸、葡萄糖：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司；維生素C：北京長城化學(xué)試劑廠。

1.1.3 主要儀器

生化培養(yǎng)箱：上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；7600-1 紫外可見分光光度計(jì)：上海菁華科技儀器有限公司；7DZ5-WS 多管架自動平衡離心機(jī)：湖南湘儀試驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；膠體磨：溫州市七星乳品設(shè)備廠。

1.2 方法

1.2.1 樹莓濁汁飲料的制作

1.2.1.1 工藝流程

樹莓凍果→解凍→破碎（護(hù)色）→膠體磨→前巴殺→冷卻→酶解→滅酶→冷卻→調(diào)配→均質(zhì)→殺菌→成品

1.2.1.2 操作要點(diǎn)

1）原料處理：將樹莓凍果在4 ℃冰箱中解凍12 h。

2）破碎：用打漿機(jī)破碎，破碎過程中加入適量VC和植酸，果漿過膠體磨抽入調(diào)配罐。

3）前巴殺（70±1）℃、冷卻（55±1）℃。

4）酶處理：加入0.1%果膠酶在50 ℃水浴中作用2 h。

5）滅酶（90±1）℃、冷卻常溫調(diào)配。

6）白砂糖、檸檬酸、檸檬酸鈉用75 ℃～80 ℃去離子水溶解后加入。飲料穩(wěn)定劑用約80 ℃去離子水溶解在乳化罐內(nèi)攪拌15 min 抽入調(diào)配罐。

7）調(diào)配罐定液位至調(diào)配量的90%，攪拌10 min 后測理化值，后調(diào)糖酸到標(biāo)準(zhǔn)值。

8）半成品理化值：糖度（4.8±0.2）BX，總酸（3.4±0.2）g/kg。

9）滅菌：將飲料灌裝封口后，100 ℃熱水中滅菌15 min。

10）加酶：飲料溫度降到50 ℃時(shí)，葡萄糖氧化酶和過氧化氫酶用0.22 μm 的膜過濾除菌，在無菌操作的條件下，按照試驗(yàn)要求加入到已滅過菌的飲料中，封口，混勻，為加速酶促反應(yīng)進(jìn)度，將飲料放置于45 ℃恒溫培養(yǎng)內(nèi)，以待檢測。

1.2.2 色澤穩(wěn)定性的測定

1）取一定的樹莓原汁，4 000 r/min 離心10 min，取上清液進(jìn)行適當(dāng)稀釋，測定樹莓濁汁在400 nm～700 nm波長下的最大吸收波長，結(jié)果見圖1。

從圖1 中可以得出，在510 nm 處樹莓有最大吸光度值，510 nm 是樹莓色素的最佳吸收波長。

圖1 樹莓濁汁的吸收光譜曲線Fig.1 Absorption spectrometry curves of cloudy raspberry juice

2）取一定的樹莓濁汁飲料，4 000 r/min 離心10 min，取上清液進(jìn)行適當(dāng)稀釋，在波長510 nm 處比色，以蒸餾水做對照，測定吸光度值。

1.2.3 花色苷含量的測定

1）取一定的樹莓濁汁飲料，4 000 r/min 離心10 min，取上清液，用pH 示差法進(jìn)行測定[5]。

總花色苷含量Total anthocyanins content（TAcy）的測定，公式如下：

式中：MW 是分子量449.2 mg/mL；DF 是稀釋因素；ε 摩爾消光系數(shù)26 900 mol-1。

2）花色苷含量變化/（mg/L）=加酶制劑的果汁中花色苷含量－對照中花色苷含量

2 結(jié)果與討論

2.1 不同酶制劑對樹莓濁汁飲料的色澤穩(wěn)定性和花色苷含量的影響

2.1.1 不同酶制劑對樹莓濁汁飲料的色澤穩(wěn)定性影響

在樹莓濁汁飲料中加入不同濃度的葡萄糖氧化酶、過氧化氫酶和葡萄糖氧化酶與過氧化氫酶（1∶1）的復(fù)合酶，24 h 后測定吸光度值，結(jié)果見圖2。

圖2 不同酶制劑對樹莓濁汁飲料色澤穩(wěn)定性的影響Fig.2 Effects of different enzymic preparations on the muddy raspberry juice pigment stability

從圖2 中可以得出，在樹莓濁汁飲料中加入不同濃度的過氧化氫酶、葡萄糖氧化酶與過氧化氫酶（1∶1）的復(fù)合酶對樹莓濁汁飲料的色澤穩(wěn)定性并沒有影響，但單一加入不同濃度的葡萄糖氧化酶，會使樹莓濁汁飲料的色澤穩(wěn)定性下降，且加入的葡萄糖氧化酶濃度越高，穩(wěn)定性越差，樹莓濁汁飲料褪色越嚴(yán)重。

2.1.2 不同酶制劑對樹莓濁汁飲料中花色苷含量的影響

在樹莓濁汁飲料中加入不同濃度的葡萄糖氧化酶、過氧化氫酶和葡萄糖氧化酶與過氧化氫酶（1：1）的復(fù)合酶，24 h 后測定濁汁飲料中花色苷的含量變化，結(jié)果見圖3。

圖3 不同酶制劑對樹莓混濁汁飲料中花色苷的影響Fig.3 Effects of different enzymic preparations on the muddy raspberry juice anthocyanins

從圖3 中可以看出，加入不同濃度的過氧化氫酶對濁汁飲料中的花色苷含量幾乎沒有影響，但是加入不同濃度的葡萄糖氧化酶對濁汁飲料中的花色苷含量有很大影響，都比對照中的花色苷含量低，且隨著葡萄糖氧化酶濃度的增加，果汁中花色苷的含量下降的也越多，樹莓濁汁飲料的褪色程度也越大。而在使用葡萄糖氧化酶與過氧化氫酶（1∶1）的復(fù)合酶時(shí)，花色苷含量與對照樣比，不僅沒有下降，而且比對照樣含量高，與初始花色苷含量比稍有下降。

分析上述結(jié)果，這與葡萄糖氧化酶與過氧化氫酶的作用機(jī)理有關(guān)。葡萄糖氧化酶在分子氧存在下能氧化葡萄糖生成D-葡萄糖酸內(nèi)酯，同時(shí)消耗氧生成過氧化氫，而產(chǎn)生的過氧化氫是強(qiáng)氧化劑，能使飲料中的主要呈色物質(zhì)—花色苷因氧化而遭到破壞，使飲料色澤穩(wěn)定性下降，花色苷含量下降。而當(dāng)使用葡萄糖氧化酶與過氧化氫酶的復(fù)合酶（1∶1）時(shí)，加入的過氧化氫酶能夠?qū)⑵咸烟茄趸冈谘趸^程中產(chǎn)生的過氧化氫分解生成水和1/2 氧，而后水又與葡萄糖酸內(nèi)酯結(jié)合產(chǎn)生葡萄糖酸。過氧化氫酶通過催化消耗氧來保護(hù)葡萄糖氧化酶，該反應(yīng)直到葡萄糖或氧消耗盡而終止，從而保護(hù)果汁中的花色苷及其他易被氧化的物質(zhì)，同時(shí)由于降低了飲料中的氧的濃度，抑制了花色苷的降解。葡萄糖氧化酶與過氧化氫酶的作用機(jī)理如下化學(xué)反應(yīng)式所示。

2.2 GOD 與CAT 的不同配比對樹莓濁汁飲料中花色苷含量的影響

2.2.1 GOD 與CAT 最佳比例關(guān)系的確定

在樹莓濁汁飲料中按不同比例加入葡萄糖氧化酶與過氧化氫酶，葡萄糖氧化酶的濃度為0.1 g/L，過氧化氫酶的加入濃度按照GOD：CAT 為1∶0.5、1∶1、1∶2和1∶3 的比例加入，每隔2 d 測定1 次，連續(xù)測定10 d，結(jié)果如圖4。

圖4 不同比例的酶對樹莓濁汁中花色苷含量的影響Fig.4 Effects of different ratio enzymic on the muddy raspberry juice anthocyanins content

從圖4 中可以得出，當(dāng)GOD：CAT 按照1∶0.5 比例加入時(shí)，飲料中的花色苷含量與對照比都明顯下降，而按照GOD：CAT 為1∶1、1∶2、1∶3 的比例加入時(shí)，花色苷含量與對照比都有所提高，但差別不大，所以選擇的GOD：CAT 最適比例為1∶1。

2.2.2 GOD 與CAT 最適加酶量的確定

在樹莓濁汁飲料中加入不同酶量的GOD 與CAT，GOD：CAT（g/L：g/L）的酶量分別是0.02∶0.02、0.1∶0.1、0.5∶0.5、1∶1，每隔2 天測定1 次，連續(xù)測定8 d，結(jié)果如表1。

表1 不同酶量的GOD 與CAT 對樹莓濁汁中花色苷含量的影響Table 1 Effects of different enzyme amount of GOD and CAT on the muddy raspberry juice anthocyanins content

從表1 中可以看到，最適的GOD 與CAT 的添加量為0.1 g/L，增加葡萄糖氧化酶與過氧化氫酶的量，花色苷的降解速率與對照比不僅沒有提高，反而下降。

分析原因，這可能與過氧化物酶（peroxidase ，POD）對花色苷的降解有關(guān)，過氧化氫酶是POD 的一種。花色苷雖不能直接被POD 氧化降解，但是在有適當(dāng)濃度H2O2存在的條件下，POD 能降解花色苷[6-11]。當(dāng)在果汁中加入大量的葡萄糖氧化酶時(shí)，可能會產(chǎn)生足夠濃度的過氧化氫，使花色苷因POD 氧化而脫色，造成花色苷的降解，所以在使用GOD 與CAT 來減緩果汁花色苷降解的過程中，一定要選擇合適比例和濃度的GOD 與CAT，否則，不但達(dá)不到減緩花色苷降解的目的，反而有相反的效果。所以，選擇的最適的GOD 與CAT 濃度均為0.1 g/L。

2.2.3 果汁中加入不同濃度的葡萄糖對樹莓濁汁飲料中花色苷含量的影響

在樹莓濁汁飲料中加入不同濃度的葡萄糖，加入葡萄糖的濃度分別為1、2、4 g/L，GOD 與CAT 的加入量為GOD：CAT 的比例為1∶1，酶量均為0.1 g/L，每2 天測定1 次，連續(xù)測定10 d，結(jié)果如圖5。

圖5 不同濃度的葡萄糖對樹莓濁汁中花色苷含量的影響Fig.5 Effects of different concentration glucose on the muddy raspberry juice anthocyanins content

從圖5 中可以得出，當(dāng)在果汁中加入1 g/L 的葡萄糖時(shí)，果汁中的花色苷含量的降解速率是最慢的，所以最適的葡萄糖添加量為1 g/L。

2.3 樹莓濁汁飲料的感官評定

根據(jù)上述優(yōu)化條件，在樹莓濁汁飲料中加入GOD、CAT 和葡萄糖，同時(shí)做對照，45 ℃培養(yǎng)10 d 后觀察，加了酶制劑的果汁顏色與對照比，顏色更鮮艷透亮，口感更好。

3 結(jié)論

花色苷是重要的功能性天然色素，是樹莓濁汁飲料保持風(fēng)味和色澤穩(wěn)定性的主要物質(zhì)，通過在樹莓濁汁飲料中加入葡萄糖氧化酶與過氧化氫酶減緩花色苷的降解，得出以下結(jié)論：

1）單獨(dú)使用葡萄糖氧化酶會產(chǎn)生強(qiáng)氧化劑—過氧化氫，使果汁中的主要呈色物質(zhì)—花色苷因氧化而降解，造成果汁飲料的褪色，因此，葡萄糖氧化酶必須與過氧化氫酶在一起配合使用。

2）試驗(yàn)表明，葡萄糖氧化酶與過氧化氫酶的最佳比例為1∶1，最適加酶量均為0.1 g/L，加入的葡萄糖濃度為1g/L 時(shí)，能達(dá)到較好的減緩花色苷降解速率的目的。

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